Введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2017 г. N 1903-ст
Межгосударственный стандарт ГОСТ 34230-2017
"ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ"
Juice products. Determination of free amino acids by high performance liquid chromatography method
МКС 67.080.01
Н69
Дата введения - 1 января 2019 г.
Введен впервые
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 Разработан Некоммерческой организацией "Российский союз производителей соков" (РСПС) при участии Акционерного общества "Мултон" (АО "Мултон") и Федерального государственного бюджетного учреждения науки "Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи" (ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии")
2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 ноября 2017 г. N 52-2017)
За принятие проголосовали:
|
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
|
Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97
|
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
|
|
Беларусь
|
BY
|
Госстандарт Республики Беларусь
|
|
Киргизия
|
KG
|
Кыргызстандарт
|
|
Россия
|
RU
|
Росстандарт
|
|
Таджикистан
|
TJ
|
Таджикстандарт
|
|
Узбекистан
|
UZ
|
Узстандарт
|
|
Украина
|
UA
|
Минэкономразвития Украины
|
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2017 г. N 1903-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34230-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.
5 Введен впервые
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на соковую продукцию из фруктов и овощей и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной обращенно-фазовой хроматографии для определения массовой концентрации (массовой доли) свободных аминокислот:
- L-Аспарагиновой кислоты;
- L-Глутамина;
- L-Глутаминовой кислоты;
- L-Серина;
- L-Гистидина;
- L-Треонина;
- L-Аспарагина;
- L-Аланина;
- L-Аргинина;
- L-Тирозина;
- γ-Аминомасляной кислоты;
- L-Метионина;
- L-Валина;
- L-Изолейцина;
- L-бета-Фенилаланина;
- L-Лейцина;
- L-Лизина;
- Глицина;
- L-Пролина;
- L(+)-Орнитина.
Диапазон измерений массовой концентрации (массовой доли) свободных аминокислот составляет от 5, 0 до 20, 0 мг/дм3 (млн-1) без учета разбавления и концентрирования проб.
Примечание - 1 млн-1 соответствует 1 мг/кг.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79* Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013** Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
ГОСТ 4199-76 Реактивы. Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003*** Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
──────────────────────────────
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.
** В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".
*** В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сущность метода
Метод основан на переводе свободных аминокислот во флуоресцирующие соединения предколоночной дериватизацией и количественном анализе полученных производных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенно-фазовых хроматографических колонках, заполненных сорбентом С18 с размером частиц менее 5 мкм с использованием флуориметрического детектора.
4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы
4.1 Хроматограф жидкостный с флуориметрическим детектором (диапазон длин волн возбуждения 200-890 нм, эмиссии 210-900 нм), относительным среднеквадратическим отклонением выходного сигнала, не более:
- по площади пика - 1 %;
- по времени удерживания - 0, 3 %;
- по площади пика за 8 ч непрерывной работы - 2 %;
- по времени удерживания за 8 ч непрерывной работы - 2 %.
4.2 Колонка хроматографическая С18* длиной 250 мм и внутренним диаметром 4, 6 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом С18 с энд-кэпингом с размером частиц менее 5 мкм.
──────────────────────────────
* Примером является хроматографическая колонка Zorbax SB С18 компании Agilent. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.
4.3 Колонка защитная (предколонка), размеры защитной колонки - 10 х 4, 6 мм, заполненная тем же обращенно-фазовым сорбентом.
4.4 Весы неавтоматического действия специального класса точности по ГОСТ OIML R 76-1, пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения массы ± 0, 001 г.
4.5 Иономер (рН-метр) с пределом абсолютной погрешности измерения ± 0, 1 ед. рН.
4.6 Пипетки градуированные лабораторные стеклянные 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5 и 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.
4.7 Посуда мерная лабораторная стеклянная 2-го класса точности по ГОСТ 1770:
- цилиндр 1-1000-2;
- колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2.
4.8 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:
- воронки В-56-80 ХС, В-75-80 ХС, В-75-110 ХС, В-100-150 ХС;
- стаканы любого типа исполнения 1 вместимостью 50, 100, 1000 см3;
- пробирки вместимостью 10 и 20 см3.
4.9 Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см3.
4.10 Палочки стеклянные длиной 220 мм и диаметром 5 мм, выполненные из химически стойкого стекла любого класса по ГОСТ 21400.
4.11 Фильтры мембранные с насадкой на шприц с размером пор 0, 20 и 0, 45 мкм.
4.12 Фильтры мембранные диаметром 47 мм с размером диаметра пор мембраны 0, 20 и 0, 45 мкм.
4.13 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
4.14 Установка для фильтрации и дегазации жидкостей.
4.15 Виалы вместимостью 2 см3 для автоматического ввода проб и вставки в виалы для микроколичеств проб.
4.16 Микрошприц вместимостью 250 мм3.
4.17 Шприц медицинский вместимостью 5 см3 многократного применения по ГОСТ 22967 или однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.
4.18 Микродозаторы пипеточные одноканальные переменного объема от 20 до 200 мм3 с соответствующими наконечниками (без воздушного промежутка) по ГОСТ 28311.
4.19 Склянки из темного стекла с завинчивающейся крышкой.
4.20 Центрифуга, обеспечивающая фактор разделения (g-фактор) не менее 800.
4.21 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода по ГОСТ ISO 3696 1-й степени чистоты.
4.22 Ацетонитрил, ос. ч., имеющий оптическую плотность не более 0, 02 при 200 нм.
4.23 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х. ч.
4.24 Тетрагидрофуран (далее - ТГФ) для хроматографии, с массовой долей основного вещества не менее 99, 9 % и показателем преломления nD в пределах от 1, 3439 до 1, 3440.
4.25 Спирт этиловый по ГОСТ 5962.
4.26 о-Фталевый альдегид с массовой долей основного вещества не менее 97 %.
4.27 3-Меркаптопропионовая кислота с массовой долей основного вещества не менее 99 %.
4.28 9-Флуоренилметоксикарбонилхлорид с массовой долей основного вещества не менее 97 %.
4.29 Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199, х. ч.
4.30 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.
4.31 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч. д. а.
4.32 Аминокислоты:
- L-Аспарагиновая кислота, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Глутамин, массовая доля основного вещества не менее 99, 0 %;
- L-Глутаминовая кислота, массовая доля основного вещества не менее 99, 0 %;
- L-Серин, массовая доля основного вещества не менее 99, 0 %;
- L-Гистидин, массовая доля основного вещества не менее 99, 0 %;
- L-Треонин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Аспарагин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Аланин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Аргинин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Тирозин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- γ -Аминомасляная кислота, массовая доля основного вещества не менее 99, 0 %;
- L-Метионин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Валин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-изо-Лейцин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-бета-Фенилаланин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Лейцин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- L-Лизин, массовая доля основного вещества не менее 98, 0 %;
- Глицин, массовая доля основного вещества не менее 98, 5 %;
- L-Пролин, массовая доля основного вещества не менее 99, 0 %;
- L-Орнитин моногидрохлорид, массовая доля основного вещества ≥ 99, 0 %.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками не ниже вышеуказанных, вспомогательного оборудования, материалов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных и химических реактивов аналогичной или более высокой квалификации.
5 Отбор проб
Отбор проб соковой продукции проводят по ГОСТ 26313.
6 Подготовка к проведению измерений
6.1 Подготовка хроматографа к работе
Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на режим и выключение по окончании работы выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации.
6.2 Общие положения
Для дериватизации аминокислот используют смесь реагентов: о-фталевого альдегида (далее - ОРА) в присутствии нуклеофильного реагента (3-меркаптопропионовой кислоты) и 9-флуоренилметоксикарбонилхлорида (далее - FMOC).
Разделение аминокислот происходит при температуре 40 °С в градиентном режиме с использованием следующих подвижных фаз:
- ацетатный буфер с рН 7, 2 ед. рН с добавкой тетрагидрофурана;
- смесь: ацетатный буфер/ацетонитрил/этанол.
Для продления срока службы и более эффективной работы колонки используют систему защиты (in-line фильтры на выходе из насоса и предколонку), периодическую промывку (не реже одного-двух раз в неделю) колонки с ацетонитрилом (в зависимости от числа проведенных анализов и концентрации органических веществ, прошедших через колонку) в течение 1-3 ч со скоростью 1, 0 см3/мин с предварительной промывкой всей системы водой. После проведения анализа и промывки колонки во избежание образования кристаллов соли вся система также промывается водой.
Операции заполнения системы растворителями и промывка отдельных частей и системы в целом выполняют в соответствии с соответствующими руководствами по эксплуатации оборудования.
Детектирование разделенных производных аминокислот осуществляют с помощью флуориметрического детектора:
- при длине волны возбуждения 266 нм и длине волны испускания 305 нм - для производных о-фталевого альдегида;
- длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания 420 нм - для производных пролина и орнитина с FMOC.
Идентификацию разделенных производных аминокислот проводят путем сравнения времен удерживания и коэффициентов удерживания со стандартной смесью аминокислот (см. приложение А).
6.3 Приготовление вспомогательных растворов
6.3.1 Приготовление раствора уксусной кислоты с массовой долей 2 %
В мерную колбу вместимостью 50 см3 приливают ориентировочно 20 см3 воды, затем приливают 0, 95 см3 ледяной уксусной кислоты и доводят водой до метки.
Раствор используют свежеприготовленным.
6.3.2 Приготовление подвижной фазы А
(4, 080 ± 0, 001) г уксуснокислого 3-водного натрия взвешивают в стакане вместимостью 100 см3, растворяют в приблизительно 80 см3 воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят водой до метки и перемешивают. Раствор переносят в мерный стакан вместимостью 1000 см3 и доводят рН до значения 7, 2 ед. рН раствором уксусной кислоты, приготовленным по 6.3.1, регистрируя показания рН-метром. К полученному раствору добавляют 2 см3 тетрагидрофурана. Полученный раствор дегазируют на установке для фильтрации и дегазации жидкостей (см. 4.15) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0, 45 мкм.
Срок хранения раствора - не более трех дней при температуре 4 °С.
6.3.3 Приготовление подвижной фазы В
В цилиндр вместимостью 1000 см3 приливают 200 см3 ацетатного буфера (подвижной фазы А), приготовленного по 6.3.2, 640 см3 ацетонитрила и 160 см3 этилового спирта. Полученную смесь перемешивают и дегазируют на установке для фильтрации и дегазации жидкостей (см. 4.15) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0, 45 мкм.
Срок хранения смеси - не более трех дней при комнатной температуре.
6.3.4 Приготовление смеси дериватизирующих реагентов о-фталевого альдегида (ОРА) и 3-меркаптопропионовой кислоты
(0, 025 ± 0, 001) г о-фталевого альдегида растворяют в 2 см3 этанола и добавляют 20 мм3 3-меркаптопропионовой кислоты.
Срок хранения смеси - не более 1 мес при температуре от 2 до 8 °С в склянке из темного стекла.
6.3.5 Приготовление раствора дериватизирующего реагента 9-метилхлороформиатфлуорена (FMOC)
(0, 05 ± 0, 001) г 9-флуоренилметоксикарбонилхлорида растворяют в 10 см3 ацетонитрила.
Срок хранения раствора - не более 1 мес при температуре от 2 до 8 °С в склянке из темного стекла.
6.3.6 Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрации 5 моль/дм3
20, 0 г гидроксида натрия растворяют в 50 см3 воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки.
Срок хранения раствора - не более 1 мес в сосуде из полимерного материала.
6.3.7 Приготовление боратного буферного раствора молярной концентрации 0, 05 моль/дм3
4, 77 г тетраборнокислого десятиводного натрия растворяют в 150 см3 воды, переносят раствор в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят водой до метки. Приготовленный раствор переносят в стакан вместимостью 1000 см3 и доводят до 10, 4 ед. рН раствором гидроксида натрия, приготовленного по 6.3.6, регистрируя показания рН-метром.
Срок хранения раствора - не более 1 мес.
6.4 Приготовление градуировочных растворов
6.4.1 Приготовление исходных градуировочных растворов аминокислот
Основной (раствор N 6), промежуточный (раствор N 5) и градуировочные растворы аминокислот (растворы N 1-4) готовят в соответствии с таблицей 2.
Примечание - При использовании в качестве солей аминокислот (например, лизина) для приготовления основного раствора необходимо пересчитывать массу навески на свободную аминокислоту.
Таблица 1
|
N раствора
|
Компонент
|
Вместимость мерной колбы, см3
|
Способ приготовления
|
Массовая концентрация, мг/дм3
|
|
6
|
L-Аспарагиновая кислота
|
100
|
(0, 100 ± 0, 001) г каждой аминокислоты взвешивают в одном стакане вместимостью 50 см3. Содержимое стакана растворяют приблизительно в 30 см3 воды, количественно переносят в мерную колбу и доводят до метки водой
|
1000
|
|
L-Глутамин
|
|
L-Глутаминовая кислота
|
|
L-Серин
|
|
L-Гистидин
|
|
L-Треонин
|
|
L-Аспарагин
|
|
L-Аланин
|
|
L-Аргинин
|
|
L-Тирозин
|
|
γ -Аминомасляная кислота
|
|
L-Метионин
|
|
L-Валин
|
|
L-изо-Лейцин
|
|
L-бета-Фенилаланин
|
|
L-Лейцин
|
|
L-Лизин
|
|
Глицин
|
|
L-Пролин
|
|
L-Орнитин
|
|
5
|
Все компоненты, что и в растворе N 6
|
100
|
В мерную колбу отбирают 10, 0 см3 основного раствора N 6, доводят до метки водой и перемешивают
|
100
|
|
4
|
Все компоненты, что и в растворе N 6
|
50
|
В мерную колбу отбирают 10, 0 см3 промежуточного раствора N 5, доводят до метки водой и перемешивают
|
20, 0
|
|
3
|
Все компоненты, что и в растворе N 6
|
50
|
В мерную колбу отбирают 7, 5 см3 промежуточного раствора N 5, доводят до метки водой и перемешивают
|
15, 0
|
|
2
|
Все компоненты, что и в растворе N 6
|
50
|
В мерную колбу отбирают 5, 0 см3 промежуточного раствора N 5, доводят до метки водой и перемешивают
|
10, 0
|
|
1
|
Все компоненты, что и в растворе N 6
|
50
|
В мерную колбу отбирают 2, 5 см3 промежуточного раствора N 5, доводят до метки водой и перемешивают
|
5, 0
|
Раствор N 4 используют в качестве одного из контрольных растворов при ежедневных анализах.
Срок хранения основного раствора N 6 - не более 5 сут при температуре от 2 до 6 °С.
Промежуточный раствор N 5 и градуировочные растворы используют свежеприготовленными.
6.4.2 Приготовление дериватизированных градуировочных растворов аминокислот
Во вставку для микроколичеств пипеточным дозатором помещают 10 мм3 градуировочного раствора (N 1-4 по таблице 1), 5 мм3 смеси ОРА и 3-меркаптопропионовой кислоты (см. 6.3.4), 5 мм3 раствора FMOC (см. 6.3.5) и 50 мм3 боратного буферного раствора (см. 6.3.7). Смесь перемешивают и сразу же проводят хроматографический анализ аминокислот. Операцию повторяют для каждого градуировочного раствора (N 1-4 по таблице 1).
К массовой концентрации аминокислот в полученном дериватизированном градуировочном растворе дополняют значение, равное массовой концентрации аминокислот в соответствующем градуировочном растворе, приведенной в таблице 1.
6.5 Условия проведения измерений
При подготовке к проведению измерений и проведении измерений соблюдают следующие условия:
|
- температура окружающего воздуха
|
(20 ± 5) °С;
|
|
- атмосферное давление
|
(97 ± 10) кПа;
|
|
- относительная влажность
|
не более 80 %;
|
|
- напряжение в питающей сети
|
(220 ± 22) В;
|
|
- частота тока в питающей сети
|
(50 ± 1) Гц.
|
6.6 Условия хроматографического анализа
При проведении хроматографического анализа создают и поддерживают следующие условия:
- температура колонки - 40 °С;
- рабочие длины волн флуориметрического детектора:
266 нм (возбуждение)/305 нм (регистрация) - для производных о-фталевого альдегида,
340 нм (возбуждение)/420 нм (регистрация) - для производных пролина и орнитина с FMOC;
- объем вводимой пробы - 10 мм3;
- режим элюирования - градиентный, скорость потока 0, 75 см3/мин (ориентировочное значение).
Параметры градиентного режима приведены в таблице 2.
Таблица 2
|
Время, мин
|
Объемная доля элюента А (см. 6.3.2), %
|
Объемная доля элюента В (см. 6.3.3), %
|
|
0
|
0
|
100
|
|
7
|
25
|
75
|
|
9
|
25
|
75
|
|
10
|
36
|
64
|
|
12
|
43
|
57
|
|
14
|
51
|
49
|
|
15
|
60
|
40
|
|
17
|
60
|
40
|
|
18
|
100
|
0
|
|
25
|
0
|
100
|
6.7 Градуировка хроматографа
Градуировку хроматографа проводят в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.
Дозируют в хроматограф дериватизированные градуировочные растворы (см. 6.4.2) после дериватизации и регистрируют площадь пиков производных соответствующих аминокислот. Площадь пиков производных аминокислот S, е. о. п. · с* и их массовая концентрация в градуировочных растворах с, мг/дм3, находятся в линейной зависимости
c=k·S,
(1)
где k - градуировочный коэффициент (угол наклона), мг·дм-3 · (е. о. п. · с)-1.
──────────────────────────────
* е. о. п. - единицы оптической плотности.
Коэффициенты k вычисляют по результатам анализа градуировочных растворов с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных или при его отсутствии в составе хроматографа по методу наименьших квадратов
,
(2)
где ci - массовая концентрация аминокислоты в i-м градуировочном растворе, мг/дм3;
Si - площадь пика соответствующей аминокислоты при анализе i-го градуировочного раствора, е. о. п. · с;
Градуировочную характеристику устанавливают при смене оборудования, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствий по результатам оперативного контроля или внутреннего аудита.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят, используя в качестве контрольных заново приготовленные по 6.4.2 дериватизированные градуировочные растворы из растворов N 3 и N 4 (см. таблицу 2) перед выполнением измерений.
Результаты контроля стабильности градуировочной характеристики признаются удовлетворительными при выполнении для каждого контрольного раствора следующего условия
|Xизм-Cст|≤0, 01·G·Cст,
(3)
где Xизм - результат измерения массовой концентрации аминокислоты в контрольных растворах, мг/дм3;
Cст - фактическое значение массовой концентрации аминокислоты в контрольных растворах, мг/дм3;
G - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, %.
Во всем диапазоне градуировочной характеристики G принимают равным 0, 7·δ, где δ - границы относительной погрешности измерений массовой концентрации аминокислот (см. таблицу 3), %.
Если условие (3) не выполняется хотя бы для одного контрольного раствора, то градуировочную характеристику устанавливают заново во всем диапазоне измерений.
6.8 Мониторинг характеристик хроматографических колонок проводят в соответствии с приложением А.
7 Проведение измерений
7.1 Подготовка проб для измерений
7.1.1 При анализе каждой пробы проводят два параллельных измерения.
7.1.2 Осветленные соки, нектары и сокосодержащие напитки, не содержащие нерастворимые в воде вещества, разбавляют в 100 раз. Для этого 1 см3 пробы сока (см. раздел 5) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Далее проводят дериватизацию аминокислот. Для этого во вставку для микроколичеств пипеточным дозатором помещают 10 мм3 разбавленной пробы, 5 мм3 смеси ОРА и 3-меркаптопропионовой кислоты (см. 6.3.4), 5 мм3 раствора FMOC (см. 6.3.5) и 50 мм3 боратного буферного раствора (см. 6.3.7). Смесь перемешивают и сразу же проводят хроматографический анализ по 7.2.3.
7.1.3 Соки, нектары и сокосодержащие напитки с мякотью или содержащие нерастворимые в воде вещества разбавляют объемным методом в 100 раз. Для этого 1 см3 пробы сока (см. раздел 5) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Далее разбавленную пробу центрифугируют со скоростью не менее 9000 об/мин в течение 10 мин и проводят все операции, предусмотренные 7.1.2, начиная с отбора аликвоты пробы во вставку для микроколичеств.
7.1.4 Концентрированные соки и пюре различных фруктов, ягод и овощей разбавляют водой в 500 раз весовым методом. Для этого взвешивают ориентировочно 0, 15 г концентрированного сока в стакане вместимостью 100 см3 с погрешностью ± 0, 001 г и доводят водой до 75 г, проводя взвешивание также с погрешностью ± 0, 001 г. Далее проводят все операции, описанные в 7.1.2.
7.1.5 При подготовке пробы по 7.1.4 результат измерений выражают в единицах массовой доли (млн-1), по 7.1.2, 7.1.3 - в единицах массовой концентрации (мг/дм3).
7.2 Порядок проведения измерений
7.2.1 Включение и вывод хроматографической системы на рабочий режим, включая кондиционирование колонки, проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации оборудования, колонки, и 6.2, 6.5.
7.2.2 Выключение хроматографической системы после выполнения анализов проводят в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программно-аппаратным комплексом сбора и обработки данных.
7.2.3 Подготовленную по 7.1.2-7.1.4 пробу вводят в хроматограф и анализируют в тех же условиях, что и дериватизированные градуировочные растворы (см. 6.6). Идентифицируют пики аминокислот по временам удерживания, используя при этом программное обеспечение к хроматографу. Для всех идентифицированных аминокислот вычисляют массовую концентрацию сизм, мг/дм3, используя градуировочные характеристики по 6.7.
Примеры хроматограмм приведены в приложении Б.
8 Обработка и оформление результатов измерений
8.1 Если подготовку пробы проводили по 7.1.2 или 7.1.3, то массовую концентрацию аминокислот в пробе С, мг/дм3, вычисляют по формуле
,
(4)
где cизм - измеренное по 7.2.3 значение массовой концентрации соответствующей аминокислоты в подготовленной пробе, мг/дм3;
V2 - объем мерной колбы, взятой для разбавления пробы, см3;
V1 - объем пробы, отобранный для анализа, см3.
За результат измерений массовой концентрации аминокислот в пробе принимают среднеарифметическое значение C̅, мг/дм3, результатов двух параллельных измерений С1 и С2, мг/дм3, при выполнении условия
,
(5)
где rотн - предел повторяемости (см. таблицу 3), %.
8.2 Если подготовку пробы проводили по 7.1.4, то массовую долю аминокислот в пробе X, млн-1, вычисляют по формуле
,
(6)
где Xизм - значение массовой доли аминокислоты в растворе, подготовленном по 7.1.4, принимаемое численно равным измеренному по 7.2.3 значению массовой концентрации, млн-1;
mобщ - масса пробы анализируемой пробы с добавкой воды (см. 7.1.3), г;
mX - масса анализируемой пробы, г.
8.3 За результат измерений массовой доли аминокислот в пробе принимают среднеарифметическое значение X, млн-1, результатов двух параллельных измерений Х1 и Х2, млн-1, при выполнении условия
,
(7)
где rотн - предел повторяемости (см. таблицу 3), %.
При невыполнении условий (5) и (7) получают еще два результата измерений в соответствии с разделом 7 и затем используют методы проверки приемлемости четырех результатов параллельных измерений и установления результата измерений согласно ГОСТ ИСО 5725-6 (подраздел 5.2).
Таблица 3 - Метрологические характеристики метода
|
Диапазон измерения массовой концентрации (массовой доли) аминокислот, мг/дм3 (млн-1)
|
Предел повторяемости (относительное расхождение результатов двух параллельных измерений) rотн, %
|
Предел воспроизводимости (допускаемое относительное расхождение результатов двух единичных измерений, полученных в двух лабораториях) Rотн, %
|
Показатель точности (границы относительной погрешности) ±δ, %
|
|
L-Пролин, L(+)-Орнитин
|
|
От 5, 0 до 20, 0 включ.
|
1, 4
|
8
|
7
|
|
L-Аспарагиновая кислота, L-Глутаминовая кислота, L-Гистидин, L-Аспарагин, L-Аланин, L-Аргинин, L-Метионин, L-бета-Фенилаланин, L-Лизин, Глицин
|
|
От 5, 0 до 20, 0 включ.
|
2, 2
|
9
|
8
|
|
L-Глутамин, L-Серин, L-Треонин, L-Тирозин, γ -Аминомасляная кислота, L-Валин, L-Изолейцин, L-Лейцин
|
|
От 5, 0 до 20, 0 включ.
|
2, 8
|
14
|
13
|
8.4 Относительное расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела значения критической разности CD0, 95
,
(8)
или
,
(9)
где C̅1 и C̅2 (X̅1 и X̅2) - результаты измерений массовой концентрации (массовой доли) аминокислот, полученные в первой и второй лабораториях соответственно, мг/дм3 (млн-1);
0, 01 - коэффициент пересчета от процентов к абсолютным величинам;
CD0, 95 - критическая разность, %.
Значение критической разности вычисляют по формуле
,
(10)
где Rотн - предел воспроизводимости (см. таблицу 3), %;
rотн - предел повторяемости (см. таблицу 3), %;
n1 и n2 - число параллельных измерений в первой и второй лабораториях соответственно.
При выполнении условий (8) или (9) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. При невыполнении этого условия рекомендуется провести мероприятия, предусмотренные ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 5.3.3 и 5.3.4).
8.5 Результаты измерений регистрируют в протоколе испытаний согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием настоящего стандарта в следующем виде
(C̅±ΔC), мг/дм3 (P=0, 95)
(11)
или
(X̅±ΔX), млн-1 (P=0, 95),
(12)
где C̅ - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений массовой концентрации аминокислот, мг/дм3;
ΔC - значение границ абсолютной погрешности измерений массовой концентрации аминокислот для доверительной вероятности Р = 0, 95, мг/дм3, вычисленное по формуле
,
(13)
где δ - значение границ относительной погрешности измерений массовой концентрации (массовой доли) аминокислот для доверительной вероятности Р = 0, 95 (см. таблицу 3), %;
X̅ - среднеарифметическое результатов двух параллельных измерений массовой доли аминокислот, млн-1;
ΔX - значение границ абсолютной погрешности измерений массовой доли аминокислот для доверительной вероятности Р = 0, 95, млн-1, вычисленное по формуле
.
(14)
9 Контроль качества результатов измерений
Контроль качества результатов измерений осуществляют, используя методы контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости и контроля стабильности среднеквадратического отклонения промежуточной прецизионности с применением контрольных карт Шухарта по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 6.2.2, 6.2.3).
Периодичность процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (пункт 4.2).
10 Требования безопасности
10.1 Условия безопасного проведения работ
При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004.
Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с руководством по эксплуатации используемого оборудования.
10.2 Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке результатов допускаются инженер-химик, техник или лаборант, имеющие высшее или специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучившие инструкцию по эксплуатации жидкостного хроматографа. Первое применение метода в лаборатории должно проводиться под руководством специалиста, владеющего теорией высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.
Приложение А
(справочное)
Мониторинг хроматографических характеристик колонки
А.1 Проверку оптимальности хроматографических условий (хроматографических характеристик колонки) проводят по хроматограмме стандартного раствора N 4 с помощью программного обеспечения или вручную по показателям в соответствии с таблицами А.1 и А.2.
Таблица А.1 - Время удерживания, коэффициент удерживания, число теоретических тарелок и коэффициент асимметрии хроматографических пиков*
|
Компонент
|
Время удерживания, мин
|
Коэффициент удерживания
|
Число теоретических тарелок N
|
Коэффициент асимметрии As
|
|
L-Аспарагиновая кислота
|
3, 54 ± 0, 18
|
0, 40
|
7165
|
1, 16
|
|
L-Глутаминовая кислота
|
6, 37 ± 0, 32
|
1, 64
|
30 690
|
1, 07
|
|
L-Аспарагин
|
7, 72 ± 0, 39
|
2, 02
|
39 442
|
0, 91
|
|
L-Треонин
|
7, 97 ± 0, 40
|
2, 21
|
38 459
|
0, 91
|
|
L-Серин
|
8, 09 ± 0, 40
|
2, 31
|
38 685
|
0, 80
|
|
L-Гистидин
|
8, 13 ± 0, 41
|
2, 75
|
6482
|
0, 30
|
|
L-Глутамин
|
8, 59 ± 0, 43
|
3, 20
|
59 911
|
1, 19
|
|
Глицин
|
9, 15 ± 0, 46
|
3, 56
|
70 633
|
1, 12
|
|
L-бета-Фенилаланин
|
9, 85 ± 0, 49
|
3, 75
|
58 876
|
1, 10
|
|
L-Аланин
|
10, 07 ± 0, 50
|
3, 88
|
75 665
|
1, 14
|
|
L-Аргинин
|
10, 36 ± 0, 52
|
4, 02
|
60 735
|
0, 56
|
|
γ-Аминомасляная кислота
|
10, 49 ± 0, 52
|
4, 19
|
45 263
|
1, 05
|
|
L-Тирозин
|
11, 02 ± 0, 55
|
4, 61
|
112 150
|
0, 31
|
|
L-Валин
|
12, 21 ± 0, 61
|
4, 66
|
98 930
|
0, 30
|
|
L-Метионин
|
12, 90 ± 0, 65
|
4, 79
|
161 106
|
1, 08
|
|
L-Изолейцин
|
14, 10 ± 0, 71
|
5, 63
|
76 388
|
0, 81
|
|
L-Лейцин
|
14, 62 ± 0, 73
|
5, 93
|
184 516
|
1, 08
|
|
L-Лизин
|
14, 91 ± 0, 75
|
6, 35
|
63 459
|
0, 85
|
|
L-Пролин
|
17, 87 ± 0, 89
|
6, 40
|
70 436
|
0, 34
|
|
L(+)-Орнитин
|
21, 9 ± 1, 10
|
7, 75
|
242 978
|
1, 67
|
* Данные значения получены при использовании хроматографической колонки Zorbax SB С18 фирмы Agilent. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.
Таблица А.2 - Разрешение хроматографических пиков аминокислот
|
Компонент
|
Разрешение Rs
|
|
L-Аспарагиновая кислота/L-Глутаминовая кислота
|
0, 21
|
|
L-Глутаминовая кислота/L-Аспарагин
|
1, 99
|
|
L-Аспарагин/L-Треонин
|
6, 67
|
|
L-Треонин/L-Серин
|
2, 98
|
|
L-Серин/L-Гистидин
|
1, 25
|
|
L-Гистидин/L-Глутамин
|
1, 40
|
|
L-Глутамин/Глицин
|
1, 30
|
|
Глицин/L-бета-Фенилаланин
|
7, 20
|
|
L-бета-Фенилаланин/L-Аланин
|
5, 20
|
|
L-Аланин/L-Аргинин
|
2, 70
|
|
L-Аргинин/ γ -Аминомасляная кислота
|
1, 80
|
|
γ -Аминомасляная кислота/L-Тирозин
|
1, 80
|
|
L-Тирозин/L-Валин
|
1, 90
|
|
L-Валин/L-Метионин
|
1, 60
|
|
L-Метионин/L-Изолейцин
|
5, 70
|
|
L-Изолейцин/L-Лейцин
|
1, 90
|
|
L-Лейцин/L-Лизин
|
8, 60
|
|
L-Лизин/L-Пролин
|
6, 40
|
|
L-Пролин/L(+)-Орнитин
|
2, 01
|
А.2 Время удерживания (абсолютное) аминокислот определяют непосредственно из хроматограмм двух параллельных измерений одной пробы. В случае обнаружения отклонения времени удерживания более чем на 5 % от стандартного значения заново устанавливают градуировочную характеристику во всем диапазоне измерений. В случае выполнения условий неравенства (4) допускается программное изменение времен удерживания компонентов.
А.3 Коэффициент удерживания (емкости) k' вычисляют по формуле
,
(А.1)
где t'R - приведенное время удерживания, мин;
tM - время выхода неудерживаемого компонента, мин.
Колонка считается удовлетворительной при значении коэффициента емкости, не превышающем 10 % от указанного в таблице А.1.
А.4 Число теоретических тарелок вычисляют по формуле
,
(А.2)
где 16 и 5, 545 - множители, вытекающие из свойств нормального распределения;
tR - время удерживания пика, мин;
Wb - ширина пика у основания, мин;
Wh - ширина пика на его полувысоте, мин.
Колонка считается удовлетворительной при значении числа теоретических тарелок не ниже 10 % от указанного в таблице.
А.5 Коэффициент асимметрии вычисляют по формуле
,
(А.3)
где А - "левый" отрезок, образованный на горизонтальной линии, проведенной на высоте 10 % от основания пика и разделенной вертикалью, опущенной из вершины пика;
В - "правый" отрезок, образованный на горизонтальной линии, проведенной на высоте 10 % от основания пика и разделенной вертикалью, опущенной из вершины пика.
Колонка считается удовлетворительной при значении коэффициента асимметрии, не превышающем 1, 75.
А.6 Разрешение Rs вычисляют по формуле
,
(А.4)
где tR2, tR1 - значения времени удерживания разделяемых полностью или критически (не полностью) компонентов, мин;
Wb1, Wb2 - ширина пиков у основания, мин.
А.7 По результатам двух параллельных измерений вычисляют средние значения Rs для пары разделяемых полностью или критически (не полностью) компонентов (n, n + 1). Колонка считается удовлетворительной при значениях Rs n, n + 1 ≥ 1, 25.
Контроль стабильности хроматографической колонки в процессе эксплуатации проводят не реже одного раза в две недели.
Приложение Б
(справочное)
Примеры хроматограмм аминокислот
Б.1 Примеры хроматограмм аминокислот приведены на рисунках Б.1, Б.2.
1 - L-Аспарагиновая кислота; 2 - L-Глутаминовая кислота; 3 - L-Аспарагин; 4 - L-Треонин; 5 - L-Серин; 6 - L-Гистидин; 7 - L-Глутамин; 8 - Глицин; 9 - L-бета-Фенилаланин; 10 - L-Аланин; 11 - L-Аргинин; 12 - γ-Аминомасляная кислота; 13 - L-Тирозин; 14 - L-Валин; 15 - L-Метионин; 16 - L-Изолейцин; 17 - L-Лейцин; 18 - L-Лизин
Длина волны возбуждения 266 нм, длина волны регистрации 305 нм.
Рисунок Б.1 - Хроматограмма дериватизированного градуировочного раствора аминокислот N 4
1 - L-Пролин; 2 - L(+)-Орнитин
Длина волны возбуждения 340 нм, длина волны регистрации 420 нм.
Рисунок Б.2 - Хроматограмма градуировочного раствора аминокислот N 4
— Все документы — ГОСТы — ГОСТ 34230-2017 ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Городом с самыми дешевыми квартирами в новостройках оказался Воронеж
Аналитик Гутман: период с мая по июль является лучшим периодом для продажи дачи
«МК»: в России не отменят льготную ипотеку
Аренда квартир в Москве подешевела на 10 %
Вице-премьер Хуснуллин: ставка по ипотеке должна быть пять процентов