Введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1766-ст
Межгосударственный стандарт ГОСТ 31744-2012 (ISO 7937:2004)
"МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. МЕТОД ПОДСЧЕТА КОЛОНИЙ Clostridium perfringens"
Microbiology of food and animal feeding stuffs. Clostridium perfringens colony-count technique
Дата введения - 1 июля 2013 г.
Введен впервые
Предисловие
Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета жизнеспособных микроорганизмов Clostridium perfringens.
Настоящий стандарт применяется при исследовании продуктов, предназначенных для употребления в пищу человеком и к кормам для животных, а также образцов окружающей среды в местах производства и оборота пищевых продуктов.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие правила микробиологических исследований
ГОСТ ISO 11133-1-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории
ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред
ГОСТ ISO 16140-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 Clostridium perfringens (С. perfringens): Бактерии, которые образуют типичные колонии (черный осадок, вызванный разложением сульфита до сульфида, который окрашивает колонии в черный цвет) в определенных селективных средах, и которые дают положительные реакции подтверждения, если испытания проводят в соответствии с одним из двух методов, указанном в настоящем стандарте.
3.2 подсчет колоний С. perfringens: Определение количества способных к росту и подтвержденных бактерий Clostridium perfringens в см3 или г образца при условии проведения испытания в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте.
4 Сущность метода
4.1 Посев в чашки Петри определенного количества испытуемой пробы, если исходный продукт жидкий, или установленного количества исходной суспензии.
Следующий посев в чашки Петри проводят в аналогичных условиях с использованием десятикратного разведения испытуемой пробы или исходной суспензии.
Добавляют селективную среду (метод пластинчатого посева) и заливают посев сверху слоем той же среды.
4.2 Анаэробная инкубация чашек при 37°С в течение (20±2) ч.
4.3 Подсчет типичных колоний
4.4 Подтверждение ряда типичных колоний и определение количества колоний С. perfringens в г или см3 продукта.
5 Разведение, питательные среды и реактивы
Для текущей лабораторной практики см. [1], ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ISO 11133-1 и ГОСТ ISO 11133-2 для приготовления, производства, проверки и применения питательных сред.
5.1 Разведения
В общем случае согласно ГОСТ ISO 7218.
5.2 Сульфит-циклосериновый агар (SC)
5.2.1 Состав в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
Ферментативный белковый гидролизат, г
|
15, 0
|
|
Ферментативный соевый гидролизат, г
|
5, 0
|
|
Дрожжевой экстракт, г
|
5, 0
|
|
Двунатрий дисульфит безводный (Na2S2O5), г
|
1, 0
|
|
Железо (III) - аммония цитрат*, г
|
1, 0
|
|
Агар, г
|
От 9, 0 до 18, 0**
|
|
Вода, см3
|
1000
|
|
* Реактив должен содержать не менее 15% железа (массовая доля).
** В зависимости от гелеобразующей способности агара.
|
5.2.1.1 Приготовление среды
Растворяют компоненты среды в горячей воде и доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал(7, 6±0, 2) при 25°С.
Разливают среду во флаконы или бутылки соответствующей емкости.
Стерилизуют в автоклаве (6.1) 15 мин при 121°С.
Хранят в холодильнике при температуре (5±3)°С не более двух недель после приготовления.
5.2.2 Раствор D-циклосерина
5.2.2.1 Состав в соответствии с таблицей 2.
Таблица 2
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
D-циклосерин*, г
|
4, 0
|
|
Вода, см3
|
100
|
|
* Используется белый кристаллический порошок.
|
5.2.2.2 Приготовление среды
Растворяют D-циклосерин в воде и стерилизуют.
Среду хранят в холодильнике при температуре (3±2)°С не более четырех недель после приготовления.
5.2.3 Полная среда
Непосредственно перед посевом чашечным методом (см. п. 9.2) добавляют 1 см3 раствора D-циклосерина (5.2.2) к каждой порции стерильной расплавленной основы среды объемом 100 см3 (5.3.1), охлажденной до 44°С- 47°С.
5.2.4 Проверка качества среды (SC)
Определение селективности и качества среды проводят по ГОСТ ISO 11133-1. Для проверки характеристик применяют ГОСТ ISO 11133-2 (таблица В.1).
5.3 Жидкая тиогликолатная среда
5.3.1 Состав в соответствии с таблицей 3.
Таблица 3
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
Ферментативный перевар казеина, г
|
10, 0
|
|
L-Цистин, г
|
0, 5
|
|
D - Глюкоза, г
|
5, 5
|
|
Дрожжевой экстракт, г
|
5, 0
|
|
Хлорид натрия, г
|
2, 5
|
|
Натрия тиогликолат (меркаптоацетат), г
|
0, 5
|
|
Агар, г
|
0, 5-2, 0*
|
|
Диазорезорин, г
|
0, 001
|
|
Вода, см3
|
1000
|
|
* В зависимости от гелеобразующей способности агара.
|
5.3.2 Растворяют компоненты в воде при необходимости раствор доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7, 3±0, 2) при 25°С.
Среду разливают по 10 см3 в пробирки 16 х 160 мм и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121°С.
Перед использованием среда должна быть деаэрирована.
5.3.3 Проверка качества тиогликолатной среды
Определение селективности и качества среды проводят по ГОСТ ISO 11133-1. Для проверки характеристик применяют ГОСТ ISO 11133-2 (таблица В.4).
5.4 Лакто-сульфитная среда (LS) (необязательно)
5.4.1 Основа среды
5.4.1.1 Состав в соответствии с таблицей 4.
Таблица 4
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
Ферментативный перевар казеина, г
|
5, 0
|
|
Дрожжевой экстракт, г
|
2, 5
|
|
Хлорид натрия, г
|
2, 5
|
|
Лактоза, г
|
10, 0
|
|
L-Цистин гидрохлорид, г
|
0, 3
|
|
D-Глюкоза, г
|
5, 5
|
|
Вода, см3
|
1000
|
5.4.1.2 Приготовление
Растворяют компоненты в воде, при необходимости раствор доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7, 1±0, 2) при 25°С.
Среду разливают по 8 см3 в пробирки с обратными трубками Дархема и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121°С.
Среду хранят в холодильнике при температуре (3±2)°С не более четырех недель после приготовления.
5.4.2 Раствор безводного метабисульфита натрия
5.4.2.1 Состав в соответствии с таблицей 5.
Таблица 5
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
Двунатрий дисульфит (Na2S2O5) безводный, г
|
1, 2
|
|
Вода, см3
|
100
|
5.4.2.2 Приготовление
Растворяют двунатрий дисульфит в воде и стерилизуют.
Раствор используют в течение дня.
5.4.3 Раствор цитрата железа (III) - аммония
5.4.3.1 Состав в соответствии с таблицей 6.
Таблица 6
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
Железа (III) - аммония цитрат, г
|
1, 0
|
|
Вода, см3
|
100
|
5.4.3.2 Приготовление раствора
Растворяют цитрат железа (III) - аммония в воде и стерилизуют раствор фильтрованием.
Раствор используют в течение дня.
5.4.4 Полная среда
Перед составлением полной среды ее деаэрируют нагреванием и последующим быстрым охлаждением. В случае хранения среды во флаконах с завинчивающимися крышками, крышки ослабляют перед нагреванием и затем завинчивают перед охлаждением.
Затем к каждым 8 см3 основы среды (5.4.1) добавляют 0, 5 см3 раствора цитрата железа (III) - аммония (5.4.3) и 0, 5 см3 раствора двунатрия дисульфита (5.4.2).
Среда используется в течение дня.
5.5 Подвижная нитратная среда (необязательно)
5.5.1 Состав в соответствии с таблицей 7.
Таблица 7
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
Ферментативный гидролизат казеина, г
|
5, 0
|
|
Мясной экстракт, г
|
3, 0
|
|
Галактоза, г
|
5, 0
|
|
Глицерин, г
|
5, 0
|
|
Азотнокислый калий (KNO3), г
|
1, 0
|
|
Динатрийфосфат (Na2HPO4), г
|
2, 5
|
|
Агар, г
|
1, 0-5, 0*
|
|
Диазорезорин, г
|
0, 001
|
|
Вода, см3
|
1000
|
|
* В зависимости от гелеобразующей способности агара.
|
5.5.2 Приготовление
Растворяют компоненты в воде, при необходимости раствор доводят до кипения. Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7, 3±0, 2) при 25°С.
Среду разливают в пробирки с выросшей разводкой-культурой по 10 см3 и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121°С. Если среду не использовали в день приготовления, то ее хранят в холодильнике при температуре (5±3)°С не более четырех недель после приготовления.
Непосредственно перед использованием подогревают в кипящей воде или на пару в течение 15 мин и затем быстро охлаждают до температуры разведения.
5.6 Нитратный реактив обнаружения (необязательно)
5.6.1 Раствор 5-амино-2-нафталинсульфокислоты (5-2-ANSA)
Растворяют 0, 1 г 5-2-ANSA в 100 см3 15% (объемная доля) раствора уксусной кислоты. Фильтруют через бумажный фильтр.
Реактив хранят в хорошо закупоренном флаконе (предпочтительно с капельницей шаровидной формы) в холодильнике при температуре (5±3)°С
5.6.2 Раствор сульфаниловой кислоты
Растворяют 0, 4 г сульфаниловой кислоты в 100 см3 15% (объемная доля) раствора уксусной кислоты. Фильтруют через бумажный фильтр.
Реактив хранят в хорошо закупоренном флаконе (предпочтительно с капельницей шаровидной формы) в холодильнике при температуре (5±3)°С
5.6.3 Приготовление полного реактива
Смешивают равные количества двух растворов 5.6.1 и 5.6.2 непосредственно перед использованием. Неиспользованный реактив уничтожают.
5.7 Цинковая пыль (необязательно)
5.8 Лактозо-желатиновая среда
5.8.1 Состав в соответствии с таблицей 8.
Таблица 8
|
Состав
|
Значение показателя
|
|
Ферментативный гидролизат казеина, г
|
15, 0
|
|
Дрожжевой экстракт, г
|
10, 0
|
|
Галактоза, г
|
10, 0
|
|
Желатин, г
|
120, 0
|
|
Фенол красный, г
|
0, 05
|
|
Вода, см3
|
1000
|
5.8.2 Приготовление среды
Растворяют компоненты в воде (кроме лактозы и фенола красного). Устанавливают уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал (7, 5±0, 2) при 25°С.
Добавляют лактозу и фенол красный. Среду разливают в пробирки по 10 см3 и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 121°С. Если среду не использовали в день приготовления, то ее хранят в холодильнике при температуре (5±3) °С не более трех недель после приготовления.
Непосредственно перед использованием подогревают в кипящей воде или на пару в течение 15 мин и затем быстро охлаждают до температуры разведения.
6 Оборудование и лабораторная посуда
Примечание - При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.
Обычное лабораторное оборудование, а также следующее:
6.1 Стерилизаторы сухожаровые (печи) или паровые (автоклавы) по ГОСТ ISO 7218.
6.2 Термостат, поддерживающий температуру (37±1) °С.
6.3 Анаэростат, обеспечивающий культивирование анаэробных микроорганизмов.
6.4 рН-метр с разрешением 0, 01 единиц рН и точностью ±0, 1 рН при 25°С.
6.5 Бактериологические петли из платино-иридиевого или никель-хромового сплава, около 3 мм в диаметре, и иглы из тех же материалов для пересева в агаровые косяки.
6.6 Приборы для фильтрования, предназначенные для стерилизации растворов.
6.7 Пробирки с размерами 16 х 160 мм с перевернутыми трубками Дархема, длиной 35 мм и диаметром 7 мм
6.8 Пипетки с полным сливом, номинальным объемом от 1 до 10 см3.
6.9 Чашки Петри, из стекла или пластмассы, диаметром 90 - 100 мм.
6.10 Водяная баня, поддерживающая температуру от 44°С до 47°С и (46±5) °С.
6.11 Резиновые колбы, используемые с градуированными пипетками для разбрызгивания компонентов нитратного реактива обнаружения (при необходимости).
7 Отбор проб
В лабораторию направляют представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или изменена в процессе транспортировки или хранения.
Отбор проб не является частью метода, приведенного в настоящем стандарте. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон касательно отбора проб конкретного продукта при отсутствии специального стандарта для данного продукта.
8 Подготовка проб для испытания
Подготовку проб проводят в соответствии со специальным стандартом для данного продукта. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон касательно подготовки проб конкретного продукта при отсутствии специального стандарта на подготовку проб данного продукта.
9 Проведение определения
9.1 Метод приготовления исходной суспензии и последующие разведения
Приготовление пробы и первичного разведения в зависимости от вида продукта согласно соответствующей части ГОСТ 26669.
9.2 Посев и инкубирование (чашечный метод)
С помощью стерильной пипетки (см. 6.8) переносят в двух повторностях 1 см3 исходной суспензии или испытуемой пробы (если продукт жидкий) в центр пустых чашек Петри (см. 6.9).
Наливают в обе чашки от 10 до 15 см3 SC агара (см. 5.2.3), подогретого в водяной бане (см. 6.10) при температуре от 44 до 47°С, и хорошо перемешивают с испытуемой пробой, осторожно вращая чашки. После затвердевания среды добавляют сверху 10 см3 дополнительно SC агара.
Оставляют чашки для затвердевания агара. Застывшие чашки агара с исходной пробой помещают в анаэростат или другие приборы, обеспечивающий культивирование анаэробных микроорганизмов, и инкубируют в анаэробных условиях в течение (20±2) ч при температуре 37°С.
Более продолжительное инкубирование может привести к излишнему почернению среды.
Повторяют процедуру с последующими десятикратными разведениями (см. 9.1).
9.3 Подсчет и выделение колоний
После установленного периода инкубации (см. 9.2) выделяют все чашки Петри, содержащие менее 150 колоний. Из них выделяют чашки с двумя последовательными разведениями. Подсчитывают на каждой чашке характерные колонии, предположительно относящиеся к С. perfringens.
Выделяют из каждой чашки 5 типичных колоний и подтверждают их, используя одну из методик описанных в п. 9.4.2. или п. 9.4.3.
9.4 Биохимическое подтверждение
9.4.1 Общие положения
Для целей подтверждения может быть использован набор сред для биохимических испытаний в соответствии с ГОСТ ISO 7218.
9.4.2 Методика подтверждения с использованием среды LS
Примечание - Реакция, протекающая в лактозо-сульфитной среде (см. 5.4) при 46°С, очень специфична для С. perfringens и С. absonum. Поэтому не обязательно добиваться дополнительной очистки черных колоний, выделенных с агаровой среды, перед их посевом на тиогликолатную и затем на лактозо-сульфитную среду.
9.4.2.1 Пересев и инкубирование
Каждую изолированную колонию (см. 9.3) пересевают на жидкую тиогликолатную среду (см. 5.3). Инкубируют в анаэробных условиях в течение 18-24 ч при температуре 37°С.
9.4.2.2 Обработка результатов
Исследуют пробирку с LS средой, учитывая образование газа и наличие черного окрашивания (осадок сульфита железа). Трубки Дархема, заполненные более чем на одну четвертую часть газом, и пробирки, содержащие черный осадок, оценивают как положительные.
В сомнительных случаях, когда трубка Дархема в пробирке с почерневшей средой заполнена газом менее чем на четверть, без промедления с помощью стерильной пипетки переносят 5 капель культуры с LS средой (см. 9.4.2.1) в другую пробирку с той же средой. Инкубируют на водяной бане (см. 6.10) при температуре от 46°С в течение 18 - 24 ч. Оценивают эти пробирки как описано выше.
Бактерии, которые образуют типичные колонии на LS среде и дают положительную реакцию подтверждения на LS среде, относят к С. perfringens. Во всех прочих случаях пробирки с посевами рассматривают как отрицательные.
9.4.3 Методика подтверждения с использованием подвижной нитратной среды и лактозо-желатиновой среды
9.4.3.1 Общие положения
Для данной методики подтверждения требуются хорошо изолированные типичные колонии. Если их нет (т.е. они чрезмерно разрослись на поверхности чашек, и нет возможности выбрать хорошо изолированные типичные колонии), засевают пять типичных колоний на предварительно деаэрированные жидкие тиогликолатные среды (см. 5.3).
Инкубируют в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 18-24 ч. Штрихуют колонии на чашках с основным агаром SC (см. 5.2.1.2) и добавляют сверху 10 см3 основного агара SC.
Дают застыть агару и инкубируют в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 18 - 24 ч. Потом выбирают из каждой чашки одну типичную и хорошо выделенную колонию.
При необходимости повторяют штрихование и посев на чашки Петри с основным агаром SC до получения хорошо изолированных, типичных колоний.
Подтверждают каждую колонию как описано в 9.4.3.2, 9.4.3.3 и 9.4.3.4.
9.4.3.2 Инокуляция и исследование подвижной нитратной среды
Инокулируют уколом каждую выделенную колонию (см. 9.3) в только что деаэрированную подвижную нитратную среду (см. 5.5).
Инкубируют в анаэробных условиях при 3°С в течение 24 ч. Исследуют пробирку с подвижной нитратной средой на тип культуры по линии укола. Подвижность очевидна по диффузному распределению бактерий в среду от линии укола.
Проводят испытание на присутствие нитрита, добавляя с помощью градуированной пипетки (см. 6.8) и резиновой колбы (см. 6.11) от 0, 2 до 0, 5 см3 нитритного реактива обнаружения (см. 5.6) в каждую пробирку с подвижной нитратной средой.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: В целях безопасности проводят это испытание в вытяжном шкафу.
Образование красного цвета подтверждает восстановление нитрата до нитрита. Если красный цвет не появляется в течение 15 мин, добавляют небольшое количество цинковой пыли (см. 5.7) и дают отстояться в течение 10 мин. Если красный цвет не появился после добавления цинковой пыли, восстановления нитрата не произошло.
9.4.3.3 Инокуляция и исследование лактозо-желатиновой среды
Инокулируют каждую выделенную колонию (см. 9.3) в только что деаэрированную лактозо-желатиновую среду (см. 5.8). Инкубируют в анаэробных условиях при 37°С в течение 24 ч.
Исследуют пробирку с лактозо-желатиновой средой на присутствие газа и желтого цвета (благодаря образованию кислоты), указывающих на ферментацию лактозы. Охлаждают пробирки при 5°С в течение 1 ч и проверяют на сжижение желатина. Если среда застыла, повторно инкубируют в течение еще 24 ч и снова проверяют на сжижение желатина.
9.4.3.4 Интерпретация
Бактерии, которые образуют черные колонии в среде SC, неподвижны, обычно восстанавливают нитрат до нитрита, вырабатывают кислоту и газ из лактозы, и сжижают желатин за 48 ч, относятся к бактериям С. perfringens. Культуры, которые дают слабую реакцию на нитрит (т.е. розового цвета) должны быть ликвидированы, так как бактерии С. perfringens дают сильную и немедленную реакцию.
10 Обработка результатов
10.1 Метод расчета
Обработка результатов по ГОСТ ISO 7218.
10.2 Сходимость
10.2.1 Межлабораторные испытания
Данные о сходимости этого метода, описанные в настоящем международном стандарте, базируются на результатах межлабораторного испытания [2]. Детали этого межлабораторного испытания приведены в приложении А. Предельные значения повторяемости и воспроизводимости определялись на трех видах продуктов, загрязненных на разных уровнях, и на контрольных материалах.
Значения, полученные на основе этого межлабораторного испытания, не могут применяться к пределам концентраций и матрицам, отличным от приведенных здесь.
10.2.2 Повторяемость
Абсолютная разность между двумя отдельными (log10-преобразованными) результатами испытаний (число С. perfringens на г или см3), или соотношение большего к меньшему из двух результатов по нормальной шкале, полученных при использовании одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале, одним и тем же оператором, использующим одно и то же оборудование, в течение короткого допустимого промежутка времени, будет превышать предел повторяемости (r) не более чем в 5% случаев.
В качестве общего показателя повторяемости (r) при испытании проб пищевых продуктов могут использоваться следующие значения. Эти значения r являются общими для всех матриц, рассматриваемых в процессе межлабораторного испытания:
r = 0, 21 для подтверждения LS или 0, 25 для подтверждения MN/LG (выраженные как разница между log10-преобразованными результатами испытания); или
r = 1, 67 для подтверждения LS или 1, 8 для подтверждения MN/LG (выраженные как соотношение большего к меньшему из двух результатов испытания).
Для контрольных материалов (см. таблицу А.4) могут применяться следующие значения:
r = 0, 13 для подтверждения LS или 0, 12 для подтверждения MN/LG (выраженные как разница между log10-преобразованными результатами испытания); или
r = 1, 3 для подтверждения LS или 1, 8 для подтверждения MN/LG (выраженные как соотношение большего к меньшему из двух результатов испытания).
Пример
Получен первый результат 10000 или 1, 0×104 предполагаемых бактерий С. perfringens на г продукта. В условиях повторяемости соотношение большего результата к меньшему не должно быть выше 1, 9. следовательно, второй результат будет между 5263 (= 10000/1, 9) и 19000 (10000 х 1, 9) предполагаемых бактерий С. perfringens на г.
10.2.3 Воспроизводимость
Абсолютная разность между двумя отдельными (log10-преобразованными) результатами испытаний (число С. perfringens на г или см3). или абсолютное соотношение между результатами двух испытаний по нормальной шкале, полученными при использовании одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях, разными операторами, использующими различное оборудование, будут превышать предел воспроизводимости (R) не более чем в 5% случаев.
В качестве показателя предела воспроизводимости (R) при испытании различных видов пищевых продуктов и контрольных материалов могут использоваться значения из таблицы 9. Эти значения r являются средними значениями, полученными в результате межлабораторного испытания для различных уровней*.
Таблица 9 - Примеры значений для R
|
Вид пробы
|
Подтверждение LS
|
Подтверждение MN и LG
|
|
R (log)*
|
R**
|
R (log)*
|
R**
|
|
Сыр
|
0, 26
|
1, 8
|
0, 31
|
2, 1
|
|
Мясо
|
0, 55
|
3, 5
|
0, 52
|
3, 3
|
|
Сухой корм для животных
|
0, 65
|
4, 5
|
0, 72
|
5, 3
|
|
Контрольный материал
|
0, 27
|
1, 9
|
0, 29
|
1, 9
|
|
* R (log) - предел воспроизводимости, выраженный как разность между
log10-трансформированными результатами испытаний.
** R - предел воспроизводимости, выраженный как соотношение между результатами испытаний.
|
Примеры
1 Во-первых, лаборатория нашла результат испытания, равный 10000 или 1, 0×104 C.perfringens на г сыра, В условиях воспроизводимости соотношение большего результата к меньшему не должно быть выше 2, 1. Следовательно, результат второй лаборатории должен быть между 4761 (= 10000/2, 1) и 21000 (10000 х 2, 1) предполагаемых бактерий С. perfringens на г.
2 Во-вторых, лаборатория хочет знать максимальный уровень, который она может найти и который соответствует установленному уровню (например, предел в 100000 или log105). Для этого значение R (0, 31 х 0, 59) является разностью между log10-трансформированными результатами испытаний, а значение 1, 52 (100, 18) представляет соотношение между результатами испытаний. Следовательно, результаты до log105, 18 (log105± log100, 18) или 152000 (100000 х 1, 52) не указывают несоответствие пределу. Коэффициент 0, 59 отражает тот факт, что испытание с односторонним 95% интервалом проводится для того, чтобы узнать, превышен ли предел. Коэффициент 0, 59 получен из следующей формулы
.
11 Протокол испытания
В протоколе испытания указывают:
а) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы:
b) метод отбора пробы, если известен;
c) использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
d) все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте, или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;
e) полученные результаты.
_____________________________
* В случае данного межлабораторного испытания значения воспроизводимости, которые должны быть выражены как общее значение, применимое ко всем пробам продуктов, очень сильно отличаются между пробами.
Приложение А
(справочное)
Результаты межлабораторного испытания
Межлабораторное совместное испытание [2], в котором принимали участие 17 лабораторий из 15 стран, проводилось на пробах сыра, мяса, сухого корма для животных и контрольном материале. Каждая проба пищевых продуктов/кормов для животных была испытана на трех различных уровнях загрязнения бактериями Clostridium perfringens.
В соответствии с ГОСТ ISO 16140, в процессе межлабораторного испытания были получены следующие параметры. Испытание было организовано Голландским национальными институтом общественного здоровья (RIVM) в январе 2000 г. и дало данные по сходимости, приведенные в таблицах А.1 - А.4.
Таблица А.1 - Результаты анализа данных, полученных на пробах сыра
|
Проба
|
Сыр (низкий уровень)
|
Сыр (средний уровень)
|
Сыр (высокий уровень)
|
|
Число лабораторий с правильными результатами
|
13
|
13
|
13
|
|
Число проб
|
2
|
2
|
2
|
|
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов
|
13
|
13
|
13
|
|
Число выбросов
|
0
|
0
|
0
|
|
Число принятых проб
|
26
|
26
|
26
|
|
Среднее значение 
|
2, 5/2, 5*
|
3, 5/3, 5*
|
4, 5/4, 5*
|
|
Среднеквадратическое отклонение повторяемости SR(log10cfu/g)
|
0, 11/0, 11*
|
0, 06/0, 07*
|
0, 08/0, 10*
|
|
Среднее относительное отклонение повторяемости
|
4, 37/4, 59*
|
1, 63/1, 97*
|
1, 85/2, 31*
|
|
Предел повторяемости r
| | | |
|
- как разность по шкале log10(log10cfu/g)
|
0, 30/0, 32*
|
0, 16/0, 19*
|
0, 23/0, 29*
|
|
- как соотношение по нормальной шкале
|
2, 0/2, 1*
|
1, 5/1, 6*
|
1, 7/1, 9*
|
|
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости SR(log10cfu/g)
|
0, 13/0, 13*
|
0, 08/0, 15*
|
0, 11/0, 14*
|
|
Среднее относительное отклонение воспроизводимости (%)
|
5, 21/5, 11*
|
2, 32/4, 38*
|
2, 50/3, 11*
|
|
Предел воспроизводимости R
| | | |
|
как разность по шкале log10(log10cfu/g)
|
0, 36/0, 35*
|
0, 23/0, 43*
|
0, 31/0, 39*
|
|
как соотношение по нормальной шкале
|
2, 3/2, 2*
|
1, 7/2, 7*
|
2, 1/2, 4*
|
|
* Первый результат был получен с использованием лактозо-желатиновой среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.
|
Таблица А.2 - Результаты анализа данных, полученных на пробах мясного фарша
|
Проба
|
Мясной фарш (низкий уровень)
|
Мясной фарш (средний уровень)
|
Мясной фарш (высокий уровень)
|
|
Число лабораторий с правильными результатами
|
13
|
13
|
13
|
|
Число проб
|
2
|
2
|
2
|
|
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов
|
13
|
13
|
13
|
|
Число выбросов
|
0
|
0
|
0
|
|
Число принятых проб
|
26
|
26
|
26
|
|
Среднее значение
|
2, 7/2, 7*
|
3, 6/3, 6*
|
4, 5/4, 5*
|
|
Среднеквадратическое отклонение повторяемости SR(log10cfu/g)
|
0, 06/0, 11*
|
0, 06/0, 10*
|
0, 11/0, 09*
|
|
Среднее относительное отклонение повторяемости (%)
|
2, 32/4, 22*
|
1, 67/2, 70*
|
2, 33/2, 01*
|
|
Предел повторяемости r
| | | |
|
- как разность по шкале log10(log10cfu/g)
|
0, 18/0, 32*
|
0, 17/0, 27*
|
0, 29/0, 25*
|
|
- как соотношение по нормальной шкале
|
1, 5/2, 1*
|
1, 5/1, 9*
|
2, 0/1, 8*
|
|
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости SR(log10cfu/g)
|
0, 14/0, 18*
|
0, 18/0, 18*
|
0, 18/0, 22*
|
|
Среднее относительное отклонение воспроизводимости (%)
|
5, 01/6, 54*
|
5, 07/5, 05*
|
3, 90/4, 76*
|
|
Предел воспроизводимости R
| | | |
|
- как разность по шкале log10(log10cfu/g)
|
0, 38/0, 49*
|
0, 51/0, 50*
|
0, 49/0, 60*
|
|
- как соотношение по нормальной шкале
|
2, 4/3, 1*
|
3, 2/3, 2*
|
3, 1/4, 0*
|
|
* Первый результат был получен с использованием лактозо-сульфитной среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.
|
Таблица А.3 - Результаты анализа данных, полученных на пробах сухого корма для животных
|
Проба
|
Сухой корм (низкий уровень)
|
Сухой корм (средний уровень)
|
Сухой корм (высокий уровень)
|
|
Число лабораторий с правильными результатами
|
13
|
13
|
13
|
|
Число проб
|
2
|
2
|
2
|
|
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов
|
13
|
13
|
13
|
|
Число выбросов
|
0
|
0
|
0
|
|
Число принятых проб
|
25
|
25
|
25
|
|
Среднее значение
|
2, 6/2, 6*
|
3, 8/3, 9*
|
4, 8/4, 9*
|
|
Среднеквадратическое отклонение повторяемости SR(log10cfu/g)
|
0, 07/0, 10*
|
0, 08/0, 8*
|
0, 06/0, 04*
|
|
Среднее относительное отклонение повторяемости (%)
|
2, 85/3, 79*
|
2, 09/1, 93*
|
1, 22/0, 75*
|
|
Предел повторяемости r
| | | |
|
- как разность по шкале log10(log10cfu/g)
|
0, 21/0, 28*
|
0, 22/0, 21*
|
0, 16/0, 10*
|
|
- как соотношение по нормальной шкале
|
1, 6/1, 9*
|
1, 7/1, 6*
|
1, 5/1, 3*
|
|
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости SR(log10cfu/g)
|
0, 32/0, 32*
|
0, 25/0, 24*
|
0, 17/0, 17*
|
|
Среднее относительное отклонение воспроизводимости (%)
|
12, 21/12, 03*
|
6, 53/6, 18*
|
3, 50/3, 49*
|
|
Предел воспроизводимости R
| | | |
|
- как разность по шкале log10(log10cfu/g)
|
0, 88/0, 88*
|
0, 69/0, 67*
|
0, 47/0, 47*
|
|
- как соотношение по нормальной шкале
|
7, 6/7, 6*
|
4, 9/4, 7*
|
3, 03/3, 0*
|
|
* Первый результат был получен с использованием лактозо-сульфитной среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.
|
Таблица А.4 - Результаты анализа данных, полученных на контрольном материале
|
Проба
|
Контрольный материал
|
|
Число лабораторий с правильными результатами
|
13
|
|
Число проб
|
2
|
|
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов
|
13
|
|
Число выбросов
|
0
|
|
Число принятых проб
|
26
|
|
Среднее значение
|
3, 7/3, 7*
|
|
Среднеквадратическое отклонение повторяемости SR(log10cfu/capsule)
| |
|
Среднее относительное отклонение повторяемости (%)
|
0, 05/0, 5*
1, 24/1, 21*
|
|
Предел повторяемости r
| |
|
- как разность по шкале log10(log10cfu/capsule)
|
0, 13/0, 12*
|
|
- как соотношение по нормальной шкале
|
1, 3/1, 3*
|
|
Среднеквадратическое отклонение воспроизводимости SR(log10cfu/capsule)
|
0, 09/0, 09*
|
|
Среднее относительное отклонение воспроизводимости (%)
|
2, 51/2, 39*
|
|
Предел воспроизводимости R
| |
|
- как разность по шкале log10(log10cfu/capsule)
|
0, 26/0, 25*
|
|
- как соотношение по нормальной шкале
|
1, 8/1, 6*
|
|
* Первый результат был получен с использованием лактозо-сульфитной среды, а второй - с использованием подвижной нитратной и лактозо-желатиновой среды.
|
Библиография
|
[1]
|
ISO 6887-2:2003
|
Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 2: Specific rales for the preparation of meat and meat products (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка проб, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологических исследований. Часть 2. Специальные правила подготовки мяса и мясных продуктов)
|
|
[2]
|
Schulten S.M., Benschop E., Nagelkerke N.J.D. и Mooijman K.A. Validation of microbiological methods: Enumeration of Clostridium perfringens according to ISO 7937 (второе издание, 1997). Отчет 286555002, Национальный институт общественного здоровья и окружающей среды, Bilthoven, Нидерланды, 2001
|
| | | |
— Все документы — ГОСТы — ГОСТ 31744-2012 (ISO 7937:2004) МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. МЕТОД ПОДСЧЕТА КОЛОНИЙ Clostridium perfringens
Городом с самыми дешевыми квартирами в новостройках оказался Воронеж
Аналитик Гутман: период с мая по июль является лучшим периодом для продажи дачи
«МК»: в России не отменят льготную ипотеку
Аренда квартир в Москве подешевела на 10 %
Вице-премьер Хуснуллин: ставка по ипотеке должна быть пять процентов