Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 30024-2012
"КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФИТАЗЫ"
(утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 августа 2012 г. N 222-ст)
Animal feeding stuffs. Determination of phytase activity
Дата введения - 1 июля 2013 г.
Введен впервые
Предисловие
1 Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4
2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 004 "Комбикорма, белково-витаминно-минеральные концентраты, премиксы"
3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 августа 2012 г. N 222-ст
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 30024:2009 "Корма для животных. Определениеактивностифитазы" (ISO 30024:2009 "Animal feeding stuffs - Determination of phytase activity")
5 Введен впервые
Введение
Настоящий национальный стандарт был разработан с целью количественного определения активности фитазы в пробах кормов, с тем чтобы предоставить возможность контроля содержания фитазы в кормовых продуктах для животных.
Вместе с тем данный метод недопускается применять для оценки эффективности фитазы в живых организмах.
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения активности фитазы в кормах.
Метод не позволяет отдельно идентифицировать фитазу, добавленную в качестве кормовой добавки.
Метод не применяют для оценки или сравнения эффективности фитазы в живых организмах.
Примечание - Метод разработан на основе имеющихся в настоящее время видов фитазы [Е1600(КФ*(1)) 3.1.3.8, 3-фитаза), Е1614 (КФ 3.1.3.26, 4-фитаза) и Е1640 (КФ 3.1.3.26, 4-фитаза)].
2 Термины и определения
В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:
2.1 единица активности фитазы (ед.) [phytase unit (U)]: Количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль неорганического фосфата из фитата за 1 мин в условиях реакций, установленных в настоящем стандарте.
3 Сущность метода
Фитаза высвобождает фосфат из субстрата мио-инозитолгексаксифосфата (фитата). Освободившийся неорганический фосфат определяют путем образования желтого комплекса с кислотным реактивом молибдата/ванадата. Оптическую плотность желтого комплекса измеряют при длине волны 415 нм, выделившийся неорганический фосфат количественно определяют при помощи градуировочной кривой, построенной на основе эталонных растворов фосфата.
4 Реактивы
В процессе анализа, если не указано иное, используют реактивы только признанной аналитической степени чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду, либо воду эквивалентной степени чистоты, не содержащую фосфатов.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Настоящий метод предусматривает использование опасных веществ. Следует соблюдать действующие нормы для потенциально опасных химических веществ с целью минимизации рисков для организационной, технической и личной безопасности.
4.1 Аммиака раствор, с массовой долей 25%, NH3.
4.2 Аммония гептамолибдата тетрагидрат, (NH4)6Mo7O24·4H2O.
4.3 Аммония монованадат, NH4VO3.
4.4 Кислота соляная, с массовой долей 25%, HCI.
4.5 Кислота азотная, с массовой долей 65%, HNO3.
4.6 Калия дигидрофосфат, KH2PO4.
4.7 Фитат, фитиновой кислоты додеканатриевая соль, C6H6Na12O24P6·xH2O, из риса, SigmaR Р0109*(2)).
4.8 Натрия ацетата тригидрат, CH3COONa·3H2O.
4.9 Полисорбат 20*(2).
4.10 Разбавленная азотная кислота
Разбавляют один объем азотной кислоты с массовой долей 65% (4.5) двумя объемами воды. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения не ограничен.
4.11 Реактив аммония гептамолибдат
Растворяют 100,0 г аммония гептамолибдата тетрагидрата (4.2) в 800 см3 воды. Добавляют 10 см3 раствора аммиака с массовой долей 25% (4.1) и доводят объем водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре в темноте. Максимальный срок хранения - 2 мес.
4.12 Реактив аммония ванадат
Полностью растворяют 2,35 г аммония монованадата (4.3) в 400 см3 воды при температуре от 50°С до 60°С. Добавляют 20 см3 разбавленной азотной кислоты (4.10) и доводят объем водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре в темноте. Максимальный срок хранения - 2 мес.
4.13 Стоп-реагент молибдат/ванадат
Смешивают один объем реактива аммония ванадата (4.12) и один объем реактива аммония гептамолибдата (4.11) и добавляют два объема разбавленной азотной кислоты (4.10). Перемешивают и хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения - один день.
4.14 Полисорбат 20, с массовой долей 10%
10,0 г полисорбата 20 (4.9) растворяют в воде и доводят объем водой до 100 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения - 6 мес.
4.15 Ацетатный буфер, рН 5,5, концентрацией 0,25 моль/дм3
34,0 г натрия ацетата тригидрата (4.8) растворяют приблизительно в 900 см3 воды. Доводят рН до 5,50±0,02 при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25% (4.4) и доводят раствор водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения - две недели.
4.16 Ацетатный буфер с полисорбатом 20 с массовой долей 0,01%, рН 5,5, концентрацией 0,25 моль/дм3
34,0 г натрия ацетата тригидрата (4.8) растворяют приблизительно в 900 см3 воды. Доводят рН до 5,50±0,02 при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25% (4.4). Добавляют 1 см3 раствора полисорбата 20 с массовой долей 10% (4.14) и доводят объем водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения - две недели.
4.17 Ацетатный буфер с полисорбатом 20 с массовой долей 0,01%, рН 5,5, концентрацией 0,50 моль/дм3
68,0 г натрия ацетата тригидрата (4.8) растворяют приблизительно в 900 см3 воды. Доводят рН до 5,50±0,02 при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25% (4.4). Добавляют 1 см3 раствора полисорбата 20 с массовой долей 10% (4.14) и доводят объем водой до 1000 см3. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения - две недели.
4.18 Раствор субстрата фитата, концентрацией 7,5 моль/дм3 (конечная концентрация в реакции - 5 моль/дм3)
2,00 г додеканатрия фитата (4.7), содержание неорганического фосфора в котором ≤0,1% по массе (см. 9.3), растворяют приблизительно в 200 см3 ацетатного буфера (4.15). Доводят рН до 5,50±0,02 при помощи раствора соляной кислоты с массовой долей 25% (4.4) и доводят раствор ацетатным буфером (4.15) до 250 см3. Максимальный срок хранения - две недели при температуре 4°С.
4.19 Исходный эталонный раствор фосфата, концентрацией 50 моль/дм3
Высушивают приблизительно 10 г калия дигидрофосфата (4.6) при температуре 105°С в течение 2 ч и помещают в эксикатор. Взвешивают приблизительно 682 мг высушенного калия дигидрофосфата, количественно переносят его в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до 100 см3 ацетатным буфером концентрацией 0,25 моль/дм3 с полисорбатом 20 с массовой долей 0,01% (4.16). Рассчитывают точную концентрацию исходного эталонного раствора фосфата. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения - две недели.
4.20 Исходный эталонный раствор фитазы
Взвешивают от 100,0 до 300,0 мг образца фитазы, количественно переносят ее в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в 100 см3 ацетатного буфера концентрацией 0,25 моль/дм3 с полисорбатом 20 с массовой долей 0,01% (4.16). Перемешивают в течение 15 - 45 мин. Хранят при комнатной температуре. Максимальный срок хранения - один день.
5 Оборудование
Используют обычное лабораторное оборудование, в частности нижеприведенное.
5.1 Баня водяная, с регулируемой температурой (со вставными секциями для пробирок вместимостью 2 см3).
5.2 рН-метр, с возможностью считывания показаний по меньшей мере до двух десятичных знаков.
5.3 Мешалки магнитные (мощностью ≥20 Вт).
5.4 Вертушки магнитные овальные (40 мм х 20 мм).
5.5 Весы аналитические, с возможностью считывания показаний как минимум до 0,1 мг.
5.6 Весы, с возможностью считывания показаний как минимум до 0,01 г.
5.7 Мешалка вихревая.
5.8 Центрифуга для микроцентрифужных пробирок (5.12), способная обеспечить ускорение от 11000g до 20000g.
5.9 Дозатор электронный.
5.10 Пипетки (электронные или ручные), способные отбирать объем в диапазоне от 0,01 до 2,00 см3.
5.11 Спектрофотометр двухлучевой или планшет-ридер.
5.12 Пробирки микроцентрифужные вместимостью 2 см3.
6 Отбор проб
В лабораторию необходимо доставить представительную пробу. Она не должна быть повреждена или изменена в процессе транспортирования или хранения.
Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемая методика отбора проб приведена в [1].
7 Приготовление пробы
Для каждой пробы проводят два взвешивания.
Взвешивают две порции гранул или порошка, по 50 г каждой, в конических колбах вместимостью 500 см3. Добавляют 500 см3 воды и 0,5 см3 раствора полисорбата 20 с массовой долей 10% (4.14) к корму и интенсивно перемешивают в течение 45 мин на магнитной мешалке (5.3) с овальными вертушками (5.4). Переносят 2 см3экстракта корма в микроцентрифужную пробирку (5.12) и центрифугируют (5.8) в течение 3 мин при ускорении 11000g - 20000g.
Неоднородность пробы может привести к высоким коэффициентам вариации (CV). Для проб корма, демонстрирующих CV > 15%, эта неоднородность может возникать из-за неравномерного распределения частиц по размерам в продуктах при приготовлении кормов. Если пробы корма демонстрируют высокие коэффициенты вариации, пробы измельчают при помощи ультрацентробежной мельницы*(3), имеющей сито с номинальным размером отверстий 1 мм. Измельчают 150 г корма и экстрагируют, как это описано в данном пункте.
8 Методика работы
— Все документы — ГОСТы — ГОСТ Р ИСО 30024-2012 КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФИТАЗЫ
Городом с самыми дешевыми квартирами в новостройках оказался Воронеж
Аналитик Гутман: период с мая по июль является лучшим периодом для продажи дачи
«МК»: в России не отменят льготную ипотеку
Аренда квартир в Москве подешевела на 10 %
Вице-премьер Хуснуллин: ставка по ипотеке должна быть пять процентов