Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54655-2011
"МЕД НАТУРАЛЬНЫЙ. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ"
(утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 804-ст)
Natural honey. Method for determination of antibiotics
Дата введения - 1 января 2013 г.
Введен впервые
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 Разработан Государственным научным учреждением Научно-исследовательским институтом пчеловодства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИ пчеловодства Россельхозакадемии) и Обществом с ограниченной ответственностью "Аналитический центр Апис"
2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 432 "Пчеловодство"
3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 804-ст
4 Введен впервые
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на натуральный мед и устанавливает метод определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина (хлорамфеникола) (далее - ХАФ) на основе твердофазного иммуноферментного анализа (далее - ИФА).
Пределы обнаружения составляют:
- для тетрациклина, ролитетрациклина - 6 мкг/кг,
- левомицетина - 0,025 мкг/кг.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1-90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия
ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия
ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия
ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля рН молока и молочных продуктов. Общие технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 19792, ГОСТ Р ИСО 5725-1, а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 антибиотики: Широкий спектр антимикробных ветеринарных препаратов (в т.ч. тетрациклины, левомицетин), используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний пчел.
3.2 остаточное количество антибиотика в меде: Массовая доля остатка антибиотика в меде, выражают в микрограммах на килограмм.
3.3 иммуноферментный анализ; ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA): Лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.
4 Требования безопасности
4.1 Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ Р 12.1.019.
4.2 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
4.3 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.
5 Отбор и подготовка пробы меда
5.1 Отбор проб - по ГОСТ 19792.
5.2 Закристаллизованный мед размягчают на водяной бане, предназначенной для равномерного обогрева с помощью трубчатых электрических нагревательных элементов мощностью не более 1000 Вт, напряжение сети 220 В, диапазон регулировки температуры от 20°С до 100°С или в сушильном шкафу по ГОСТ 14919 при температуре не выше 40°С и продавливают металлическим или пластмассовым шпателем с длиной рабочей поверхности не менее 20 мм через сито по ГОСТ Р 51568. Крупные механические частицы удаляют вручную.
5.3 Сотовый мед распечатывают, отделяют от сот с помощью металлического сита без нагревания.
6 Определение присутствия и массовой доли антибиотиков тетрациклиновой группы
6.1 Сущность метода
Базовым принципом для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в меде является твердофазный конкурентный ИФА на планшетах из полистирола. Метод основан на конкуренции свободного антибиотика из меда и антибиотика, предварительно адсорбированного на твердой фазе (лунке планшета) в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к тетрациклинам антител во вносимом растворе. После отделения не связавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью вторичных антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител определяют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в анализируемой пробе, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.
6.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы и реактивы
6.2.1 Фотометр микропланшетный вертикального сканирования с фильтрами, соответствующими длине волны 450 нм.
6.2.2 Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом дозирования 0,010 - 0,100 см3; 0,100 - 1,000 см3 и 1,000 - 5,000 см3одноканальные.
6.2.3 Дозаторы пипеточные автоматические восьмиканальные с переменным объемом дозирования 0,050 - 0,300 см3.
6.2.4 Наконечники для автоматических пипеток вместимостью от 0,300 до 1,000 и до 5,000 см3 однократного применения.
6.2.5 Анализатор потенциометрический с пределом допускаемой основной погрешности измерений ±0,01 ед. рН по ГОСТ 19881.
6.2.6 Весы по ГОСТ Р 53228, с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,1 мг и не более ±0,002 г.
6.2.7 Шейкер лабораторный для пробирок.
6.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
6.2.9 Центрифуга настольная с эффективностью не менее 3000 g или иного типа с теми же характеристиками.
6.2.10 Ультразвуковая ванна с эффективной мощностью ультразвука 60 Вт.
6.2.11 Аппарат универсальный для встряхивания.
6.2.12 Стаканы химические вместимостью 50, 100 см3 по ГОСТ 25336.
6.2.13 Колбы мерные вместимостью 1000 см3 по ГОСТ 1770.
6.2.14 Цилиндры мерные 2-25-1 по ГОСТ 1770.
6.2.15 Набор реагентов для количественного определения тетрациклина типа "Ридаскрин Тетрациклин".
6.2.16 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 2-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98%.
6.2.17 Натрий фосфорнокислый 1-замещенный 1-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98%.
6.2.18 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.
6.2.19 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.
6.2.20 Вода для лабораторного анализа категории 1 по ГОСТ Р 52501.
6.2.21 Твин 20, имп.
6.2.22 Стеклянные виалы вместимостью 1,5, 80 см3 с завинчивающимися крышками.
6.2.23 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
6.2.24 Термостат или другое устройство, позволяющее производить равномерный нагрев до температуры 40°С.
6.3 Характеристика набора для иммуноферментного определения тетрациклинов
Для иммуноферментного определения тетрациклинов применяют промышленно изготовленные наборы, характеристики которых должны быть не ниже указанных в 6.3.1.
6.3.1 Состав набора*
6.3.1.1 Планшет микротитровальный на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных препаратом тетрациклина, - 1 шт.
6.3.1.2 Комплект стандартных растворов тетрациклина со следующими массовыми концентрациями 0; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5; 121,5 нг/см3 в водном растворе по 1,3 см3 - 6 флаконов.
6.3.1.3 Раствор антител - 6,0 см3.
6.3.1.4 Конъюгат вторичных антител с пироксидазой - 10,0 см3.
6.3.1.5 Субстрат/хромоген, содержащий пероксид карбамида (мочевины) и тетраметилбензидин, - 10,0 см3.
6.3.1.6 Стоп-реагент, содержащий 1 Н серную кислоту, - 14,0 см3.
6.3.1.7 Буфер 1 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов - 50,0 см3.
6.3.1.8 Смесь солей для приготовления 1 дм3 моющего буфера.
Примечание - Набор рассчитан на проведение 48 определений в двух повторностях, включая анализируемые пробы и калибровочные растворы (всего 96 определений на один планшет).
6.3.2 Аналитические характеристики набора
6.3.2.1 Специфичность метода
Метод анализа при использовании набора характеризуется показателем специфичности, составляющим для:
тетрациклина - 100%;
ролитетрациклина - 100%;
хлортетрациклина - 42%;
демеклоциклина - 27%;
окситетрациклина - 13%;
доксициклина - 8%.
6.3.2.2 Чувствительность метода
Пределы обнаружения:
- тетрациклина, ролитетрациклина - 6 мкг/кг;
- хлортетрациклина - 15 мкг/кг;
- демеклоциклина - 23 мкг/кг;
- окситетрациклина - 50 мкг/кг;
- доксициклина - 75 мкг/кг.
Показатель извлекаемости тетрациклина из меда - (107±11)%.
6.3.3 Рекомендации по использованию наборов
6.3.3.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор. Разбавление или замена реагентов, использование реагентов из набора с другим номером партии могут привести к потере чувствительности или ошибке определения.
6.3.3.2 Необходимо хранить наборы при температуре 2°С - 8°С.
Не допускается хранение при отрицательной температуре и замораживание реагентов набора. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) их герметично упаковывают в оригинальный фольгированный пакет вместе с имеющимся осушителем.
6.3.3.3 Необходимо избегать попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором хромогена из-за его светочувствительности.
6.3.3.4 Раствор хромогена подкрашен в розовый цвет для удобства использования. В случае окрашивания раствора хромогена в голубой цвет его применение для анализа не допускается, поскольку такое окрашивание раствора хромогена является признаком порчи.
6.3.3.5 Сроки хранения отдельных компонентов набора указаны на упаковке.
6.3.4 Требования техники безопасности при проведении определений
6.3.4.1 Стандартные растворы содержат тетрациклин, поэтому требуется особая осторожность.
6.3.4.2 Стоп-реагент содержит серную кислоту, поэтому следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.
6.4 Проведение испытаний с применением набора
6.4.1 Отбор и подготовка проб меда - по разделу 5.
6.4.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси молярной концентрации 0,1 моль/дм3
(4,00±0,01) г натрия гидроокиси по 6.2.19 взвешивают в стакане вместимостью 100 см3 по 6.2.12, растворяют в 75 см3 воды для лабораторного анализа по 6.2.20, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3 по 6.2.13, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.
6.4.3 Приготовление фосфатного буфера 1 молярной концентрацией 20 ммоль/дм3 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов
(0,55±0,01) г натрия фосфорнокислого 1-замещенного 1-водного по 6.2.17 взвешивают в стакане вместимостью 50 см3 по 6.2.12, растворяют в 25 см3 воды для лабораторного анализа, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3. Аналогично взвешивают и растворяют (2,85±0,01) г натрия фосфорнокислого 2-замещенного 2-водного по 6.2.16 и (9,00±0,01) г натрия хлористого по 6.2.18, оба раствора количественно переносят в туже мерную колбу. В ту же колбу добавляют 800 см3 воды для лабораторного анализа. Раствор тщательно перемешивают. Измеряют значение рН приготовленного раствора, которое должно составлять 7,4 ед. рН. В случае несоответствия значения рН довести его до требуемой величины добавлением в мерную колбу 0,1 Н раствора гидроокиси натрия по 6.4.2. Раствор доводят до метки водой и тщательно перемешивают.
Срок хранения буферного раствора при температуре 6°С - 10°С - не более одного года.
6.4.4 Приготовление моющего буферного раствора с твином 20
Фосфатный буферный раствор готовят по 6.4.3. Количественно переносят 500 см3 в мерную колбу вместимостью 1000 см3. Дополнительно в мерную колбу добавляют 0,5 см3 твина 20 по 6.2.21, доводят водой до метки и тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре 6°С - 10°С - не более одного года.
6.4.5 Приготовление анализируемой пробы
Взвешивают (1,00±0,001) г меда, подготовленного по разделу 5, в стеклянной виале вместимостью 80 см3. Добавляют (49,00±0,001) г фосфатного буфера 1 по 6.4.3 и тщательно завинчивают крышку виалы. Виалу помещают в ультразвуковую ванну по 6.2.10 на 5 мин. Затем раствор интенсивно перемешивают на шейкере по 6.2.7 в течение 2 мин. Перед анализом встряхивают пробы вверх-вниз.
6.4.6 Приготовление реагентов для анализа
Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной в пределах 20°С - 25°С, а после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2° - 8°С в холодильных приборах по ГОСТ 16317.
В процессе выполнения анализа нельзя допускать высыхания лунок планшета. На всех стадиях определения необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.
Растворы антител, конъюгата, субстрата/хромогена, стоп-реагента, входящие в состав набора, поставляются в готовом к употреблению виде. Перед употреблением достаточно вскрыть флакон.
6.4.7 Приготовление стандартных растворов
Подготовку стандартных растворов проводят только в одноразовых стеклянных виалах вместимостью 1,5 см3.
Для подготовки к использованию стандартных растворов тетрациклина концентраты стандартных растворов, входящих в состав набора, разбавляют буфером 1 (таблица 1). После разбавления необходимо тщательно перемешать готовые растворы.
После каждой серии определений необходимо готовить свежие стандартные растворы.
Построение градуировочной кривой необходимо проводить для каждой серии определений.
Таблица 1 - Приготовление стандартных растворов тетрациклина
— Все документы — ГОСТы — ГОСТ Р 54655-2011 МЕД НАТУРАЛЬНЫЙ. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ
Городом с самыми дешевыми квартирами в новостройках оказался Воронеж
Аналитик Гутман: период с мая по июль является лучшим периодом для продажи дачи
«МК»: в России не отменят льготную ипотеку
Аренда квартир в Москве подешевела на 10 %
Вице-премьер Хуснуллин: ставка по ипотеке должна быть пять процентов