Утв. Приказом федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 октября 2011 г. N 456-ст
Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 9233-2-2011
"СЫРЫ И ПЛАВЛЕНЫЕ СЫРЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НАТАМИЦИНА. Часть 2. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ"
Cheese and processed cheese. Determination of natamycin content. Part 2. High-performance liquid chromatographic method
Дата введения - 1 января 2013 г.
Введен впервые
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") при участии Государственного научного учреждения "Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ "ВНИИМС") на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4
2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"
3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 октября 2011 г. N 456-ст
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 9233-2:2007 "Сыры, сырные корки и плавленые сыры. Определение содержания натамицина. Часть 2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для сыров, сырных корок и плавленых сыров" (ISO 9233-2:2007 "Cheese, cheese rind and processed cheese - Determination of natamycin content - Part 2: High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese").
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004 (пункт 3.5)
5 Введен впервые
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения массовой доли натамицина свыше 0, 5 мг/кг в сырах, сырных корках и плавленых сырах и массы натамицина на единицу площади поверхности свыше 0, 03 мг/дм2 в сырных корках.
2 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
2.1 содержание натамицина (natamycin content): Массовая доля вещества, определенного в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.
Примечание - Содержание натамицина выражают в миллиграммах на килограмм.
2.2 масса натамицина на единицу площади поверхности в сырной корке (surface-area-related natamycin mass in cheese rind): Масса натамицина на единицу площади поверхности, определенная в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.
Примечание - Массу натамицина на единицу площади поверхности выражают в миллиграммах натамицина на квадратный дециметр сырной корки.
2.3 сырная корка (cheese rind): Наружный слой сыра толщиной 5 мм, за исключением слоя покрытия, если оно присутствует.
3 Сущность метода
Экстрагируют метанолом известное количество пробы. Экстракт разбавляют водой с последующим охлаждением до температуры от минус 15°С до минус 20°С для осаждения большей части жира, а затем фильтруют. Определяют в фильтрате (при необходимости после концентрирования) содержание натамицина или массу натамицина на единицу площади поверхности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
4 Реактивы
Используют только реактивы признанного аналитического качества, если не оговорено иначе, а также только дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.
4.1 Метанол (CH3OH).
4.2 Метанол, водный раствор.
Смешивают два объема метанола (4.1) и один объем воды.
4.3 Стандартные растворы натамицина
4.3.1 Стандартный основной раствор натамицина концентрацией 500 мг/дм3
Непосредственно перед использованием растворяют в метаноле (4.1) в мерной колбе с одной меткой вместимостью 100 см3 (5.1) количество препарата с известным содержанием натамицина, соответствующее 50 мг чистого натамицина (C33H47NO13). Доводят до метки водой и перемешивают.
4.3.2 Стандартный рабочий раствор натамицина концентрацией 5 мг/дм3
В мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 (5.1) отбирают пипеткой 5, 0 см3 стандартного основного раствора натамицина (4.3.1). Разбавляют до метки водным раствором метанола (4.2) и перемешивают. Отбирают пипеткой 5, 0 см3 разбавленного таким образом раствора в другую мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см3 (5.1). Разбавляют до метки водным раствором метанола (4.2) и перемешивают. Концентрация этого стандартного рабочего раствора натамицина составляет 5 мкг/см3. Концентрация должна быть близкой к концентрации испытуемого раствора, измеренной в 8.3.3. При необходимости регулируют концентрацию этого стандартного рабочего раствора путем отбора пипеткой и разбавления другого количества основного раствора.
4.4 Уксусная кислота (CH3CO2H), ледяная.
5 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.
5.1 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 50 и 100 см3.
5.2 Ломтерезка или аналогичное устройство, способное нарезать ломтики сыра толщиной 5 мм и шириной примерно 30 мм (см. рисунок А.1).
5.3 Ломтерезка для тонкой нарезки, способная нарезать тонкие ломтики сыра максимальной толщиной 1 мм (см. рисунок А.2).
5.4 Измельчитель или смеситель.
5.5 Острый нож, способный разрезать ломтики сыра на небольшие кусочки.
5.6 Магнитная мешалка или аппарат для встряхивания.
5.7 Конические колбы вместимостью 100 и 200 см3, изготовленные из цветного стекла и снабженные притертыми стеклянными пробками.
5.8 Шприцы одноразовые вместимостью 10 см3.
5.9 Мембранные микрофильтры с размером пор от 0, 20 до 0, 45 мкм, стойкие к воздействию спиртовых растворов.
5.10 Складчатые бумажные фильтры, быстрофильтрующие, диаметром 150 мм (например, S и S, No. 595 1/2*).
5.11 Воронка диаметром приблизительно 70 мм.
5.12 Морозильная камера, способная замораживать при температуре от минус 15°С до минус 20°С.
5.13 Экстракционные гильзы для концентрирования, при необходимости, отфильтрованного экстракта.
5.14 Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, способный проводить измерения при длине волны 303 нм и оборудованный регистрирующим устройством и/или интегратором.
5.15 Аналитическая колонка длиной 150 мм, внутренним диаметром 4, 6 мм, типа С8, с размером частиц 5 мкм (например, Lichrosorb RP8*).
5.16 Защитная колонка длиной 100 мм, внутренним диаметром 2, 1 мм, типа С8, с размером частиц от 30 до 40 мкм.
5.17 Емкость для хранения пробы подходящей вместимости.
6 Отбор проб
В лабораторию следует поставлять представительную пробу. Она не должна быть подвержена порче или изменению во время транспортирования или хранения.
Отбор проб не рассматривается в методе, установленном в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приводится в ИСО 707.
Лабораторная проба должна составлять целую головку сыра или ее сегмент, представляющий целую головку.
7 Приготовление пробы для испытания
7.1 Сырная корка
При необходимости разрезают пробу для испытания на сектора или более мелкие части так, чтобы ширина сырной корки была не более 30 мм. С помощью ломтерезки (5.2) отделяют всю корку от всех полученных секторов или частей, нарезая ломтиками максимальной толщиной 5 мм. Из полученной корки вырезают с помощью острого ножа (5.5) прямоугольный кусок площадью от 2 до 4 дм2. Определяют площадь его поверхности в квадратных дециметрах и массу в килограммах. Тщательно измельчают (5.4) всю корку, включая взвешенный и измеренный кусок, и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в емкость для хранения пробы (5.17). После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой, горячей водой, а затем метанолом (4.1). Тщательно сушат все инструменты, например, струей сжатого воздуха.
7.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр
После удаления корки (7.1) используют ломтерезку для тонкой нарезки (5.3) для получения ломтика максимальной толщиной 1 мм со всего наружного среза пробы для испытания. Нарезают все ломтики пробы на мелкие куски площадью приблизительно 50 мм2 и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в емкость для хранения пробы (5.17). После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой для испытания, горячей водой, а затем метанолом (4.1). Тщательно сушат все инструменты, например, струей сжатого воздуха.
8 Проведение испытания
8.1 Подготовка пробы для анализа
8.1.1 Сырная корка
В коническую колбу вместимостью 200 см3 (5.7) взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 10, 00 г пробы для испытания (7.1).
8.1.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр
В коническую колбу вместимостью 100 см3 (5.7) взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 5, 00 г пробы для испытания (7.2).
8.2 Приготовление испытуемого раствора
8.2.1 Сырная корка
8.2.1.1 Первоначальная подготовка
В коническую колбу к пробе для анализа (8.1.1) добавляют 100 см3 метанола (4.1). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (5.6). Добавляют 50 см3 воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (5.12) приблизительно на 60 мин.
8.2.1.2 Фильтрование
Холодный экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр (5.10), отбрасывая первые 5 см3 фильтрата. Фильтрование следует проводить, пока суспензия остается еще холодной, чтобы избежать растворения жира и, следовательно, образования мутных фильтратов. Доводят фильтрат до комнатной температуры. С помощью шприца (5.8) отбирают порцию фильтрата. Фильтруют через мембранный микрофильтр с размером пор 0, 45 мкм (5.9), а затем через мембранный микрофильтр с размером пор 0, 20 мкм (5.9). Минимальное требуемое количество испытуемого раствора (фильтрата) составляет 20 мкл на ввод для прямого хроматографического измерения (8.3.4) и 25 см3 или 50 см3 для измерения при 5- или 10-кратной концентрации (8.3.5) соответственно.
8.2.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр
8.2.2.1 Первоначальная подготовка
В коническую колбу к пробе для анализа (8.1.2) с помощью измерительного цилиндра добавляют 50 см3 метанола (4.1). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (5.6). С помощью измерительного цилиндра добавляют 25 см3 воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (5.12) приблизительно на 60 мин.
8.2.2.2 Фильтрование
Фильтруют раствор, как описано в 8.2.1.2.
8.3 Определение
8.3.1 Определение и пределы обнаружения
Лаборатория, которая применяет данный метод, должна установить пределы обнаружения и провести определение в собственных инструментальных условиях, используя признанные методы расчета, для верификации того, что натамицин может быть определен при концентрациях вплоть до 0, 5 мг/кг и 0, 03 мг/дм2.
8.3.2 Настройка жидкостного хроматографа (5.14)
Рекомендуется следующий хроматографический режим:
подвижная фаза: метанол (4.1) - вода - уксусная кислота (4.4) - 12:8:1 (объемных частей);
поток: 1 см3/мин;
установка детектора: 303 нм, 0, 005 оптической единицы, вся шкала;
регистрирующее устройство: 10 мВ;
число теоретических (типичных) тарелок: минимум 1500.
При использовании другой колонки, отличной от приведенной в качестве примера (5.15), регулируют соотношение метанол:вода. Однако заданное относительное количество уксусной кислоты (4.4) к метанолу является существенным для сохранения максимальной оптической плотности при 303 нм. Для определения времени удерживания и проверки калибровочного графика (8.3.3) перед испытанием каждой серии проб в хроматограф должен вводиться стандарт с известным содержанием натамицина. Поскольку натамицин не устойчив в водном метаноле, выполняют измерение как можно быстрее.
8.3.3 Построение калибровочного графика
Отбирают пипеткой 1, 2, 4, 6 и 8 см3 стандартного рабочего раствора натамицина (4.3.2) соответственно в серию мерных колб с одной меткой вместимостью 50 см3 (5.1). Доводят до метки водным метанолом (4.2) и перемешивают. Полученные таким образом калибровочные растворы содержат 0, 1; 0, 2; 0, 4; 0, 6 и 0, 8 мкг/см3 натамицина соответственно. Поочередно вводят в колонку по 20 мкл каждого калибровочного раствора. Определяют площадь или высоту полученных пиков. Наносят на график полученные площадь или высоту пика для каждого раствора по оси ординат относительно концентрации натамицина, в микрограммах на миллилитр, по оси абсцисс. HPL-хроматограмма образца приведена на рисунке А.3.
8.3.4 Испытуемый раствор
Вводят 20 мкл испытуемого раствора (8.2.1.2 или 8.2.2.2). Измеряют площадь или высоту пика с таким же временем удерживания, что и калибровочные растворы натамицина. Выполняют измерение по возможности быстрее. Если площадь или высота пика испытуемого раствора настолько мала, что интерполяция по калибровочному графику невозможна или почти невозможна, а определение тем не менее необходимо, следуют методике, указанной в 8.3.5. Примеры HPL-хроматограмм испытуемых растворов приведены на рисунке А.4.
Примечание - Присутствие в сыре специй, особенно перца, может мешать определению, поскольку на хроматограмме может образовываться пик с тем же временем удерживания, что и у пика, соответствующего натамицину. Разделение этих двух пиков может быть достигнуто путем градиентного элюирования или изократического использования альтернативной подвижной фазы метанол (4.1): фосфатный буфер, рН 4, 5 с соотношением 11:9 объемных частей. Раствор фосфата для буферного раствора можно приготовить при растворении 3, 026 г дигидроортофосфата калия в 1 дм3 воды.
8.3.5 Низкое содержание натамицина
8.3.5.1 Концентрирование
Решают вопрос о необходимости использования приблизительно 5- или 10-кратной концентрации. Основывают это решение на результате, полученном в 8.3.4, и на требуемом пределе определения. Затем в химический стакан отбирают пипеткой 25 см3 или 50 см3 (для 5- или 10-кратной концентрации соответственно) испытуемого раствора (8.2.1.2). В зависимости от требуемой концентрации добавляют 50 или 100 см3 воды соответственно и перемешивают. Активируют экстракционную гильзу (5.13), используя от 3 до 5 см3 метанола (4.1). Затем промывают 10 см3 воды. Пропускают разбавленный испытуемый раствор через гильзу со скоростью от 3 до 5 см3/мин с помощью шприца (5.8). Таким же образом промывают гильзу 10 см3 воды и элюируют натамицин 3 см3 метанола (4.1).
8.3.5.2 Измерение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
Разбавляют элюат (8.3.5.1) до 5 см3 метанолом (4.1). Продолжают измерение, как указано в 8.3.4.
9 Расчет и выражение результатов
9.1 Расчет массовой доли натамицина
Массу натамицина во введенной аликвоте испытуемого раствора можно определить путем интерполяции по калибровочному графику (8.3.3).
Содержание натамицина в виде массовой доли w, мг/кг, в испытуемой пробе рассчитывают по формуле
,(1)
где cn - концентрация натамицина в испытуемом растворе (8.2.1.2 или 8.2.2.2), мкг/см3;
m - масса пробы для анализа (8.1.1 или 8.1.2), г;
V - общий объем испытуемого раствора (8.2.1.1 или 8.2.2.1), см3.
Примечание - В том случае, если испытуемый раствор приготовлен из сыра, отобранного из-под корки, w представляет собой содержание натамицина в результате миграции в сыр.
9.2 Расчет массы натамицина на единицу площади поверхности
Массу натамицина на единицу площади поверхности mA, n, мкг/дм2, рассчитывают по формуле
,(2)
где wr - массовая доля натамицина в пробе для испытания, взятой из сырной корки (7.1), мкг/кг;
m - масса взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (7.1), кг;
А - площадь взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (7.1), дм2.
9.3 Поправка, вводимая в результат
В том случае, если отфильтрованный экстракт подвергался концентрированию, как указано в 8.3.5, вносят поправку в результаты испытания для w (9.1) и mA, n (9.2) следующим образом:
a) для приблизительно 5-кратной концентрации делят полученный результат на 5;
b) для приблизительно 10-кратной концентрации делят полученный результат на 10.
Если требуется параллельное определение при условии соблюдения требований к повторяемости, за конечный результат содержания натамицина в пробе для испытания принимают среднеарифметическое результатов двух определений, полученных в соответствии с разделом 10, округленное с точностью до первого десятичного знака.
9.4 Обработка результатов
Выражают результаты испытания с точностью до первого десятичного знака.
10 Прецизионность
10.1 Межлабораторные испытания
Значения повторяемости и воспроизводимости были получены по результатам межлабораторного испытания, проведенного в соответствии с ИСО 5725:1986 [2] (относительно результатов см. [4]).
10.2 Повторяемость
Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на идентичном испытуемом материале в одной лаборатории одним оператором на одном и том же оборудовании в пределах короткого промежутка времени, будет не более чем в 5% случаев превышать значения, указанные в таблице В.1.
10.3 Воспроизводимость
Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях разными операторами на различном оборудовании, будет не более чем в 5% случаев превышать значения, указанные в таблице В.1.
11 Протокол испытания
Протокол испытания должен содержать:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
b) используемый метод отбора проб, если известен;
c) используемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
d) все подробности, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробностями всех побочных обстоятельств, которые могут повлиять на результат(ы) испытания;
e) полученный(е) результат(ы) испытания и, в случае проверки повторяемости, конечный полученный результат.
_____________________________
* Пример подходящего продукта, имеющегося в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения этого продукта национальным органом по стандартизации.
Приложение А
(справочное)
Примеры
Рисунок А.1 - Пример ломтерезки для нарезания кусков сырной корки толщиной 5 мм (5.2)
Рисунок А.2 - Пример ломтерезки для тонкой нарезки ломтиков сыра максимальной толщиной 1 мм (5.3)
Рисунок А.3 - HPL-хроматограмма образца стандартного раствора, содержащего 0, 5 мкг/см3 натамицина
Рисунок А.4 - Примеры HPL-хроматограмм различных испытуемых растворов
Приложение В
(справочное)
Результаты межлабораторных испытаний
Результаты были получены в соответствии с ИСО 5725 при совместном исследовании, проведенном в 1984 году в 36 лабораториях, которые использовали восемь проб. Значения в миллиграммах на квадратный дециметр были рассчитаны из значений в миллиграммах на килограмм для сырных корок толщиной 5 мм и плотностью 1, 3 г/см3.
Таблица В.1 - Параметры прецизионности
|
Натамицин
|
Коэффициент вариации повторяемости CV(r), %
|
Коэффициент вариации воспроизводимости CV(R), %
|
Относительная повторяемость, rrel=2, 83·CV(r), %
|
Относительная воспроизводимость, Rrel=2, 83·CV(R), %
|
|
Масса на единицу площади поверхности, мг/дм2
|
Массовая доля, мг/кг
|
|
4(а)
|
60(а)
|
9, 3
|
20, 6
|
26
|
60
|
|
1(а)
|
15(а)
|
7, 1
|
25, 6
|
20
|
70
|
|
0, 08(b)
|
1, 3(b)
|
23, 4
|
37
|
65
|
105
|
|
0, 02(b)
|
0, 3(b)
|
29
|
39
|
80
|
110
|
|
(а) Прямое определение.
(b) Определение после 10-кратного концентрирования.
|
Библиография
|
[1]
|
ISO 707/IDF 50 Milk and milk products - Guidance on sampling
|
|
[2]
|
ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests
|
|
[3]
|
DE RUIG W.G., VAN OOSTROM J.J., LEENHEER, K. Spectrometry and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese and cheese rind. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 944-8
|
|
[4]
|
DE RUIG, W.G. Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 949-54
|
— Все документы — ГОСТы — ГОСТ Р ИСО 9233-2-2011 СЫРЫ И ПЛАВЛЕНЫЕ СЫРЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НАТАМИЦИНА. Часть 2. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Городом с самыми дешевыми квартирами в новостройках оказался Воронеж
Аналитик Гутман: период с мая по июль является лучшим периодом для продажи дачи
«МК»: в России не отменят льготную ипотеку
Аренда квартир в Москве подешевела на 10 %
Вице-премьер Хуснуллин: ставка по ипотеке должна быть пять процентов