МУК 4.2.1776-03 МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ASPERGILLUS AWAMORI ВНИИГЕНЕТИКА 120/177-ПРОДУЦЕНТА ГЛЮКОАМИЛАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

Государственные санитарно-эпидемиологические
правила и гигиенические нормативы

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток Aspergillus awamori
ВНИИгенетика 120/177-продуцента глюкоамилазы
в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1776-03

МИНЗДРАВ РОССИИ

МОСКВА 2004

Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.

1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток Aspergillus awamori ВНИИгенетика 120/177-продуцента глюкоамилазы в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1776-03

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Aspergillus awamori ВНИИгенетика 120/177 - продуцента глюкоамилазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

На 5 день развития на сусло-агаре штамм образует крупные ровные круглые колонии, средний диаметр которых составляет 0,5 - 1,0 см, а максимальный - 1,5 - 3,0 см. Край колоний ровный. Колонии гомогенные, гладкие, плоские.

При температуре 38 - 42 °С штамм-продуцент появляется на сусло-агаре в виде маленьких белых колоний уже на 1 - 2 дни. На 3-й день в среду выделяется оранжево-желтый пигмент, процесс спорообразования идет интенсивнее. Образование конидиеносцев с конидиями придает колониям глубокий интенсивно-серый цвет. Колонии становятся опущенными и приподнимаются над средой.

Систематическое положение микроорганизма

Штамм Aspergillus awamori 120/177 получен во ВНИИгенетика как мутант из A.awamori С529Д 466 и депонирован в ЦМПМ института. Штамм является продуцентом глюкоамилазы.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 27 - 30 °С, рН среды 5,0 - 6,0, культивирование 7 суток. Для размножения используется агаризованная среда Чапека, сусло-агар 5 - 6 °Б, картофельно-сахарозный агар.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./м³, А.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по типичнымкультурально-морфологическим признакам и яркому оранжево-желтому окрашиванию субстрата на 3 сутки.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

Прибор для бактериологического анализа

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)                      ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные

или водяные

Автоклав электрический                                                            ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением ´ 10                                                            ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные,

стеклянные, диаметром 100 мм

Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл              ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                                                ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                                                ГОСТ 1770-74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл                     ГОСТ 1770-74

Секундомер                                                                                  ГОСТ 9586-75

Барометр                                                                                       ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                                                     ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                                        ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Среда сусло-агар: солодовое сусло (значение Баллинга от

5 до 6°) - 98 %, агар-агар - 2 %, рН среды 5,0 - 6,0, режим

стерилизации: 1,1 - 1,2 ати, 40 мин

Спирт этиловый ректификат                                                      ГОСТ 5962-67

Молочная кислота, синоним-альфа-

оксипропионовая кислота (для подавления

посторонней бактериальной флоры)                                         ГОСТ 490-79

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 3 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам и яркой оранжево-желтой пигментации среды. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют молочную кислоту из расчета 2 мл на 0,5 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 38 - 42 °С (повышенная температура, способствующая более быстрому росту колоний и плодоношений рода Aspergillus). Через 2 - 3 суток производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле: