УТВЕРЖДАЮ Главный государственный
санитарный врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 24 октября 2003 г. Дата
введения: 1 декабря 2003 г. |
4.2. МЕТОДЫ
КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ
КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК CANDIDA TROPICALIS Y-456 - ПРОДУЦЕНТА КСИЛИТА
В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
Методические указания
МУК 4.2.1773-03
1. Общие положения и область
применения
Настоящие методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток
штамма Candida tropicalis Y-456 -
продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с
требованиями ГОСТ
17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам
определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96
«Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в
установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией
«Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды»
Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
2. Биологическая характеристика
Candida tropicalis Y-456 и его гигиенический норматив
На сусло-агаре на 2-3 сутки штамм образует круглые кремоватые
колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колоний составляет 0,3
см, а максимальный - 0,8 см. В центре колоний образуется небольшое возвышение -
«бугорок», на среде появляется маленькое желто-оранжевое окрашивание.
Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка
матовая.
Морфологически штамм представлен полиморфными
клетками: округлые, овальные, большей частью одиночные 2-4 мкм, иногда цепочки
или конгломераты из вытянутых клеток 10-12 мкм. Наблюдается обилие бластоспор.
При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау в
чашках Петри обильно образуются псевдогифы с многократными разветвлениями и
бластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф (8).
Систематическое положение микроорганизма
Класс | Fungi imperfecti |
Порядок | Blastomycetales |
Род | Candida |
Вид | tropicalis |
Штамм | Y-456 |
Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцент
этанола и селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах с ксилозой.
Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на средах с 5 % содержанием
ксилозы: максимальная -80 % ксилита, средняя - 78,8-76,2 % (39,5 г/л) ксилита.
Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных
средах. Оптимальная температура роста 35-37 °С, рН среды - 5,0-6,0. Для
размножения используется сусло-агар 5-6°Б, среда ДАП - глюкоза (ксилоза) - 20
г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, пептон - 2 г, агар-агар -20 г, вода - 1 л, рН
среды - 5,0-6,0.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном
воздухе населенных мест - 30 кл/м3, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества
клеток дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне
концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной
вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток
дрожжеподобного гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших
колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки развития.
В качестве дополнительного контроля предлагается отбор пробы на чашку Петри с
селективной средой для дифференцирования С. tropicalis от других дрожжеподобных
грибов, обладающих способностью к образованию ростковых трубок (9,10).
5. Средства измерений, вспомогательные
устройства,
реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства
измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Прибор для бактериологического
анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова) | ТУ 64-12791-77 | Термостаты
электрические суховоздушные или водяные | | Автоклав
электрический | ГОСТ 9586-75 | Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами | | Холодильник бытовой | | Весы
лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 | | Микроскоп
биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 | | Лупа с
увеличением ×10 | ГОСТ 25706-83 | Чашки Петри
бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм | | Пробирки
биологические, вместимостью20 и 35 мл Пипетки мерные
на 1,5 и 10 мл Пипетки мерные
на 1,5 и 10 мл | ГОСТ 10515-75 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 1770-74 | Колбы
конические, вместимостью 250 и 500 мл | ГОСТ 1770-74 | Секундомер | ГОСТ 9586-75 | Барометр | ГОСТ 24696-79 | Марля
медицинская | ГОСТ 9412-77 | Вата медицинская
гигроскопическая | ГОСТ 25556- 81 |
|
5.2.
Реактивы, растворы Среда
сусло-агар: солодовое сусло (значение Баллинга от 5 до 6°) - 98 %,
агар-агар - 2 %, рН среды 5,0-6,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/см2,
40 мин. | | Спирт этиловый
ректификат | ГОСТ 5962-67 | Сыворотка или плазма крови человека (
вместо них можно использовать среду 199). тибиотик
биомицин (хлортетрациклина гидрохлорид). | |
|
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма
продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с
химическими реактивами по ГОСТ
12.1.005-88..
6.2. Электробезопасность при работе с
электроустановками по ГОСТ
12.1.005-88.и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. «Инструкции по устройству, требованиям
безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях
предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в
вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом
осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую
подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к
анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С),
атмосферном давлении 30-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток продуцента воздух
аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность
среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит от предполагаемой
концентрации клеток штамма-продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха
тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность
подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку
крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,
одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки
прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,
прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной
чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации
и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных колоний,
выросших на 2 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим
признакам. Метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают
до 50-60 °С, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки
Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки
при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки
используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха, чашки Петри помещают в термостат при
температуре 37 °С. На 2-е сутки производят подсчет выросших типичных колоний
продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
Для постановки дополнительного контроля в среду
добавляют сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой 199)
из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб инкубируют при 37
°С в течение 3 часов. При микроскопировании некоторые дрожжеподобные грибы (С.
albicans) в отличие от С. tropicalis на селективной среде образуют ростковые
трубки диаметром 3-4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но не дают
сужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1
м' воздуха производят по формуле:
Администратор
04.10.2013
