ГОСТ ISO 9231-2015 МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СОРБИНОВОЙ И БЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТ В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

Milk and milk products. Determination of sorbic and benzoic acids in milk and dairy products

Дата введения - 1 июля 2017 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Республиканским унитарным предприятием "Республиканский научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию"

2 Внесен Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 февраля 2015 г. N 75-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 июня 2016 г. N 642-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 9231-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 9231/IDF 139:2008 "Молоко и молочные продукты. Определение бензойной и сорбиновой кислот" ("Milk and milk products - Determination of the benzoic and sorbic acids contents").

Международный стандарт ISO 9231/IDF 139 был подготовлен Техническим комитетом ISO/ТС 34 "Пищевые продукты", Подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" и Международной молочной федерацией (IDF). Документ издается совместно ISO и IDF.

В разделе "Нормативные ссылки" и тексте стандарта ссылки на международный стандарт актуализированы.

В стандарт внесены незначительные редакционные изменения.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта в связи с особенностями системы межгосударственной стандартизации.

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международного стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном органе по техническому регулированию и метрологии.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Введен впервые

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания бензойной и сорбиновой кислот в молоке и молочных продуктах.

Метод применим для молока, сухого молока, йогурта и других кисломолочных продуктов, для сыра и плавленого сыра и позволяет определять содержание сорбиновой и бензойной кислот в концентрациях более 5 мг/кг.

Для применения данного стандарта необходимы следующие документы, которые представлены в виде ссылок. Для ссылок на публикации с указанием года их издания действительны только указанные издания. Для ссылок на публикации без указания года издания действительно последнее издание приведенной публикации (включая поправки и изменения).

ISO 1042 Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой

Для целей настоящего стандарта применяются следующие термины и определения:

3.1 содержание бензойной и сорбиновой кислот: Количество бензойной и сорбиновой кислот в миллиграммах на килограмм молока или молочного продукта, определенное по настоящему стандарту.

Жиры и белки удаляют из слабого щелочного раствора продукта осаждением растворами Карреза. Надосадочную жидкость фильтруют и добавляют метанол. Бензойную и сорбиновую кислоты разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с применением обращенно-фазовой колонки C₁₈, измеряя поглощение на длинах волн 227 и 250 нм.

Используют только реагенты признанной аналитической чистоты и дистиллированная или деионизированная вода или вода соответствующей чистоты.

5.1 Метанол (CH₃OH)

5.2 Растворы для осаждения (растворы Карреза 1, 2)

5.2.1 Раствор гексацианоферрата калия (II)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3) помещают 10, 6 г гексацианоферрата (II) калия трехводного (K₄[Fe(CN)₆] ·3H₂O) и растворяют в воде. Доводят водой до метки и перемешивают.

Примечание - 100 см³ раствора достаточно для проведения 40 анализов.

5.2.2 Раствор ацетата цинка

Растворяют 21, 9 г ацетата цинка двухводного [(CH₃COO)₂ Zn 2H₂O] и 32 см³ уксусной кислоты (CH₃COOH) в воде в мерной колбе вместимостью 100 см³ (6.3).

Доводят водой до метки и перемешивают.

Если двухводный ацетат цинка полностью не растворяется, нагревают колбу и ее содержимое на водяной бане (6.2) при температуре 70°С и постоянном перемешивании. После растворения двухводного ацетата цинка раствор охлаждают до комнатной температуры. Доводят водой до метки и перемешивают.

Примечание - 100 см³ раствора достаточно для проведения 40 анализов.

5.3 Фосфатный буферный раствор, рН 6, 7

Растворяют 2, 5 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и 2, 5 г гидрофосфата калия трехводного (K₂HPO₄·3H₂O) в 1 дм³ воды и перемешивают. Полученный раствор фильтруют с помощью системы фильтрации растворителей (6.8).

5.4 Подвижная фаза для ВЭЖХ

Смешивают 10 объемных частей метанола (5.1) с 90 объемными частями раствора фосфатного буфера (5.3). Излишки газа удаляют легким вакуумом.

5.5 Раствор гидроокиси натрия, c(NaOH) = 0, 1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ (6.3) помещают 4, 0 г гранул гидроокиси натрия и растворяют в воде (6.3). Доводят водой до метки и перемешивают.

5.6 Серная кислота, c(H₂SO₄) = 0, 5 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 500 см³ (6.3), содержащую 250 см³ воды, осторожно вносят 15 см³ концентрированной серной кислоты с массовой долей от 95 до 98% и охлаждают. Полученный раствор доводят водой до метки и перемешивают.

5.7 Стандартные растворы сорбиновой и бензойной кислот

5.7.1 Основной стандартный раствор

В мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3) помещают 50 мг сорбиновой кислоты и 50 мг бензойной кислоты и растворяют в метаноле (5.1). Доводят метанолом (5.1) до метки и перемешивают.

Основной стандартный раствор годен в течение трех недель при хранении в холодильнике при температуре 4-7°С.

5.7.2 Рабочий стандартный раствор

Для получения водно-метанольного раствора с объемными долями 50% смешивают 500 см³ метанола (5.1) с 500 см³ воды.

В день проведения испытания пипеткой отбирают 5 см³ основного раствора (5.7.1) и помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³ (6.3). Доводят 50% водно-метанольным раствором до метки и перемешивают. Полученный рабочий раствор содержит 10 мкг/см³сорбиновой и бензойной кислот.

6.1 Весы аналитические с наименьшим пределом взвешивания 1 мг и ценой деления 0, 1 мг.

6.2 Водяная баня с возможностью поддерживания температуры (70±2)°С.

6.3 Мерные колбы вместимостью 100, 250, 500 и 1000 см³, соответствующие требованиям ISO 1042 для класса А.

6.4 Жидкостной хроматограф, оснащенный насосом высокого давления с верхним пределом давления не менее 4, 37 мПа (6000 PSI), двухволновым УФ-детектором или УФ-детектором с диодной матрицей, самописцем или интегратором.

Двухволновой детектор должен иметь длину оптического пути, равную 1 см, и возможность измерения оптической плотности на длине волны 227 нм - для бензойной кислоты и 250 нм - для сорбиновой кислоты.

6.5 Колонка для ВЭЖХ, изготовленная из нержавеющей стали, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4 мм, заполненная обращенно-фазовым кремниевым сорбентом с привитыми октадецильными группами, например, Micro-Bondapak С18* или ее аналог.

6.6 Шприц для ВЭЖХ.

6.7 Набор мембранных фильтров для водных проб с размерами пор фильтра 0, 45 мкм.

6.8 Система фильтрации растворов, включая мембранные фильтры для водных растворов, размером пор 0, 45 мкм.

6.9 Ультразвуковая баня.

6.10 рН-метр.

В лабораторию направляется репрезентативная проба без повреждений или изменений во время транспортировки или при хранении.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора приведен в [1].

При хранении испытуемого образца необходимо принимать меры, не допускающие порчи образца и изменения его состава.

8.1 Йогурты или другие кисломолочные продукты

Перед началом анализа образец гомогенизируют, осторожно нагревая при температуре 40°С при постоянном перемешивании. В мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3) помещают 20± 0, 1 г гомогенизированного образца.

8.2 Другие молочные продукты

В стеклянный лабораторный стакан вместимостью 20 см³ помещают 3±0, 1 г пробы. Испытуемый образец полностью диспергируют в 10 см³ воды, добавляя воду небольшими порциями при постоянном перемешивании стеклянной палочкой.

Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ (6.3), дважды ополоснув стакан 5 см³ воды.

9.1 Осаждение жиров и белков и очистка

К испытуемой пробе (по 8.1 или 8.2) прибавляют 25 см³ раствора гидроокиси натрия (5.5) и перемешивают. Колбу и ее содержимое помещают в ультразвуковую баню (6.9) на 15 мин. или нагревают на водяной бане (6.2) при температуре 70°С в течение 15 мин. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры.

К испытуемому раствору при постоянном перемешивании добавляют раствор серной кислоты (5.6) и доводят рН раствора до 8±1 ад. рН. Для осаждения жиров и белков добавляют 2 см³ раствора гексацианоферрата (II) калия (5.2.1) и 2 см³ раствора ацетата цинка (5.2.2). Энергично встряхивают и оставляют полученную суспензию для отстаивания на 15 мин. Затем добавляют 40 см³ метанола и перемешивают. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры.

Метанолом (5.1) доводят раствор до метки и снова перемешивают. Раствор оставляют на 15 мин. Надосадочную жидкость фильтруют при помощи мембранных фильтров (6.7).

9.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

ВЭЖХ-анализ проводят при комнатной температуре с использованием подвижной фазы (5.4) и скоростью потока 1, 2 см³/мин. Перед началом анализа в течение 30 мин. хроматографическую систему промывают элюирующим раствором до установления стабильной нулевой линии.

Затем хроматографируют прозрачный раствор пробы, подготовленной по 9.1, и рабочий градуировочный раствор (5.7.2), инжектируя равные объемы в диапазоне от 5 до 20 мм³. Выходящий из колонки элюат анализируют УФ-детектором при длинах волн 227 и 250 нм, используя последовательное детектирование при настройках на две длины волны или одновременное двухволновое детектирование.

Примечание - Для проверки линейности градуировочного графика проводят точечную градуировку.

Количество метанола в стандартных растворах и испытуемом образце намного выше, чем в подвижной фазе, что в некоторых случаях может повлиять на форму и разделение пиков. В таких случаях проверяют форму и разделение пиков, сравнивая их с пиками, полученными при хроматографировании стандартного раствора (5.7.1), в котором метанол (5.1) замещен на мобильную фазу (5.4) в эквивалентном количестве.

В данных условиях ориентировочное время удерживания бензойной и сорбиновой кислот составляет 5, 5 и 7 мин. соответственно. Если пики выходят за пределы градуировочного графика, образец разбавляют необходимым объемом 50% водного метанола и вводят в хроматограф от 5 до 20 мм³ полученного раствора для получения пиков нужной высоты.

Чтобы определить, элюируются ли в пробе какие-либо мешающие компоненты одновременно с сорбиновой кислотой, проверяют отношение УФ-сигналов при длине волны 250 и 227 нм.

В ходе анализа молока или сухого молока на хроматограмме после 8 мин. удерживания появляется третий пик. Этот пик соответствует природному продукту - гиппуровой кислоте. Пик гиппуровой кислоты может частично накладываться на сорбиновую кислоту. Поэтому разрешение сорбиновой и гиппуровой кислот на колонке должно быть больше 1.

Содержание сорбиновой кислоты w_s и/или бензойной кислоты w_b, выраженное в миллиграммах на килограмм, рассчитывают по формуле:

,

где H_ts- высота или площадь пика, в соответствующих единицах, полученные для испытуемого раствора (см. 9.2);

H_st - высота или площадь пика, в соответствующих единицах, полученные для рабочего стандартного раствора (см. 9.2);

m_s - масса, в микрограммах, введенного рабочего стандартного раствора (5.7.2);

m - масса, в граммах, испытуемого образца (см. 8.1 или 8.2);

V₁ - объем, в см³, экстракта, приготовленного в 9.1 (= 100 см³);

V₂ - объем, в мм³, введенного испытуемого раствора;

1000 - коэффициент пересчета миллилитров в микролитры. Результаты испытания представляют с точностью до целого числа.

11.1 Межлабораторные испытания

Значения, полученные в ходе межлабораторных испытаний, могут быть не применимы для иных, отличных от указанных, матриц и уровней содержания кислот.

Значения повторяемости и воспроизводимости были получены на основании результатов двух межлабораторных испытаний, проводимых в 1984 и 2004 годах (см. приложение А). Испытания проводились на образцах с уровнем содержания бензойной и сорбиновой кислот в пределах от 6 до 920 мг/кг.

11.2 Повторяемость

Абсолютная разность между результатами двух параллельных испытаний, полученными с использованием одного и того же метода в одной и той же пробе в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором, использующим то же самое оборудование, в короткий интервал времени, не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению: (2, 235+0, 031·w̅_s) (или w̅_b) мг/кг, более чем в 5% случаев.

11.3 Воспроизводимость

Абсолютная разность между результатами двух отдельных испытаний, полученными с использованием одного и того же метода в одной и той же пробе в различных лабораториях различными операторами, использующими различное оборудование, не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению: ((8, 987+0, 130·w̅_s)) (или w_b) мг/кг, более чем в 5% случаев.

Протокол испытания должен содержать как минимум следующую информацию:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

b) используемый метод отбора проб;

c) используемый метод испытания со ссылкой на этот стандарт;

d) все рабочие детали, не установленные в этом стандарте или рассматриваемые как факультативные, вместе с деталями всех нюансов, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e) полученные результаты анализа и, если выполняется условие повторяемости, окончательный средний результат.

_____________________________

* Micro-Bondapak С18 R доступное коммерческое название продукта. Эта информация дана для удобства пользователей стандарта, но не является рекомендацией названного продукта.

Приложение А
(справочное)

Значения повторяемости и воспроизводимости были получены на основании результатов двух международных межлабораторных испытаний, проводимых в 1984 [4] и 2004 [6] годах соответственно.

Результаты, полученные в ходе этих испытаний, были подвергнуты статистическому анализу в соответствии с [2]* и [3]*. Данные прецизионности приведены в таблице А.1.

Параметр	Бензойная кислота				Сорбиновая кислота
	1984 [4]	1984 [4]	2004 [6]	2004 [6]	1984 [4]	2004 [6]	2004 [6]
Образцы	А(а)	В(а)	C(b)	D(b)		С(b)	D(b)
Количество лабораторий	14	14	9	14	14	14	14
Количество выбывших лабораторий	2	2	1	1	3	1	0
Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбывших	12	12	8	13	11	13	14
Среднее значение, мг/кг	26, 4	40, 6	7, 61	35, 0	36, 1	920	57, 0
Повторяемость, r, мг/кг	2, 0	3, 8	1, 6	4, 4	3, 4	30, 5	4, 5
Повторяемость относительно среднего значения, rrel, %	7, 7	9, 4	20, 5	12, 7	9, 4	3, 3	7, 8
Стандартное отклонение повторяемости, sr %	0, 7	1, 3	0, 6	1, 6	1, 2	10, 8	1, 6
RSDr %	2, 7	3, 3	7.2	4.5	3, 3	1, 2	2, 8
Воспроизводимость, R, мг/кг	13, 5	15, 3	11, 0	9, 9	12, 1	128, 9	18, 6
Воспроизводимость относительно среднего значения, Rrel, %	51, 1	37, 7	144	28, 4	33, 5	14, 0	32, 6
Стандартное отклонение воспроизводимости, sR, мг/кг	4, 8	5, 4	3, 9	3, 5	4, 3	45, 6	6, 6
RSDR, %	18, 1	13, 3	50, 9	10, 0	11, 9	5, 0	11, 5
(а) Образцы А и В: Ароматизированный йогурт. (b) Образцы С и D: Плавленый сыр (дополнительную информацию см. в литературном источнике [6]). (с) В ходе подготовки пробы добавлена сорбиновая кислота до концентрации 40 мг/кг.

Используя линейный регрессионный анализ, была получена следующая линейная регрессия х = b + ay с коэффициентом корреляции 0, 9973486 для n = 7, s = 0, 8249 и t_{0, 95} = 2, 57 (см. рисунок А.1)

для сорбиновой кислоты r = 2, 2354088 + 0, 0307787 w̅_s и

для бензойной кислоты r = 2, 2354088 + 0, 0307787 w̅_b

Используя линейный регрессионный анализ, была получена следующая линейная регрессия, х = b + ay с коэффициентом корреляции 0, 9989653, для n = 7, s = 2, 1815 и t_{0, 95}= 2, 57 (см. рисунок А.2)

для сорбиновой кислоты R = 8, 9874655 + 0, 1304663 w̅_s и

для бензойной кислоты R = 8, 9874965 + 0, 1304663 w̅_b.

Рисунок А.1 - Повторяемости как функция среднего значения

Рисунок А.2 - Воспроизводимость как функция среднего значения

_____________________________

** В Российской Федерации действуют ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения", ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений", ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений" и ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода".

Приложение ДА
(справочное)

Таблица ДА.1

Обозначение международного стандарта	Степень соответствия	Обозначение и наименование межгосударственного стандарта
ИСО 707 | IDF 50	-	*, *
ISO 1042:1998	-	*
ISO 5725-2:1994	-	*, **
* Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

_____________________________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 707-2010 "Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб".

** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений".

Библиография

[1]	ИСО 707 | IDF 50	Milk and milk products - Guidance on sampling (Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб)
[2]	ISO 5725-1:1994	Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions [Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения]
[3]	ISO 5725-2:1994	Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method [Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений]
[4]	STIJVE Т. и HISCHENHUBER С. Определение низких уровней бензойной и сорбиновой кислот в йогуртах высокоэффективной жидкостной хроматографией, Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 80 (1984), pp. 81-84
[5]	BUÜTIKOFER H., BAUMANN E. и BOSSET F.O. Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., 79 (1988), pp. 392-405
[6]	CARLM. и BÜTIKOFER U. Bulletin of the International Dairy Federation, publication in preparation