МУК 4.2.1783-03 МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА PENICILLIUM CANESCENS F-832 - ПРОДУЦЕНТА КСИЛАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

Государственные санитарно-эпидемиологические
правила и гигиенические нормативы

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Penicillium canescens F-832 - продуцента ксиланазы
в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1783-03

МИНЗДРАВ РОССИИ

МОСКВА 2004

Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.

1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации

клеток микроорганизма Penicillium canescens F-832 –

продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1783-03

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 - продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Микроорганизм Penicillium canescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой. На твердом сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре 30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, диаметром 2 - 3 мм. На 4 - 5 сутки инкубации размеры колонии достигают 5 - 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колоний оранжево-коричневая.

Штамм устойчив практически ко всем широко известным антибиотикам.

ПДК штамма в воздухе рабочей зоны 2000 кл/м³, А.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Прямой метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды (сусло-агар) и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

Прибор для бактериологического анализа

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)                       ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический                                                              ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением ´ 10                                                             ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические

плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм

Пробирки биологические, вместимостью 20 и

35 мл                                                                                               ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                                                  ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                                                  ГОСТ 1770-74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл                       ГОСТ 1770-74

Секундомер                                                                                    ГОСТ 9586-75

Барометр                                                                                         ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                                                      ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                                         ГОСТ 25556-81

Антибиотики: группы пенициллина,

тетрациклина, цефалоспорина и др.

амфотерицин или нистатин

Спирт этиловый ректификат                                                       ГОСТ 5962-67

Среда для штамма-продуцента: агаризованное

пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-продуцента

(агар - 1,8 %, рН 5,9 - 6,1, режим стерилизации

1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин)

Бенгальский розовый

Диметилсульфоксид

Спирт этиловый ректификат                                                       ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента.

Состав среды: КН₂РО₄ - 1 г; MgSO₄×7Н₃О -

0,5 г; (NH₄)₂SO₄ - 0,7 г; целлюлоза порошковая

в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза -

0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г;

вода дистиллированная - до 1000 мл

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.

Для определения продуцента ксиланазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Прямой метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 3 - 5 сутки после посева воздуха и позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (пенициллин, стрептомицин, цефалотин или другой), для подавления посторонней бактериальной микрофлоры) и нистатина или амфотерицина 15 мкг/мл для подавления грибковой флоры. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

При выполнении анализа воздуха рабочей зоны косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 30 °С. На 3 - 5 сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента по культурально-морфологическим признакам или по зонам просветления вокруг колоний как результат действия ксиланазы на окрашенную целлюлозу. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле: